联苯胺试验对血痕DNA检验的影响

金 明，巴华杰，朱爱华，马 骏，石津玮，刘亚楠 ，林子清

（1.常州市公安局物证鉴定所，江苏 常州 213003；2.上海市公安局物证鉴定中心 法医物证学现场应用技术公安部重点实验室 上海市现场物证重点实验室，上海 200083；3.中国刑警学院法医学系，辽宁 沈阳 110035）

联苯胺试验为案发现场可疑血痕常用的预检验方法之一[1-2]，因其灵敏度高、检验方法简便、结果判断明确等优点，已成为现场可疑血痕筛选的首选方法[3]。已有研究[4]显示，联苯胺试验对血痕中的DNA有显著的破坏作用，联苯胺试验后的血痕不能再进行STR分型检验。因此在实际操作中多用滤纸转移部分可疑血痕进行联苯胺试验，以避免联苯胺试验对血痕DNA的破坏。然而，实践中常会遇到需要对联苯胺试验显现后的潜隐血指掌纹中的血痕继续进行STR分型检验，此时就无法避免联苯胺试验及相关试剂对血痕中DNA的破坏，从而影响后续的STR分型检验。随着近年来DNA提取方法的不断改进，DNA提取的效率和质量不断提升。同时，STR分型复合扩增试剂盒的灵敏度和抗抑制能力也得到了不断的改善。可见，有必要对联苯胺试验后的血痕能否进行常规STR分型检验进行重新评估，这对于实际案件中联苯胺试验后血痕（特别是联苯胺试验显现指掌纹后的血痕）的STR分型检验具有重要的指导意义。本研究拟探讨联苯胺试验对DNA提取产生的影响，以发现对DNA提取影响较小的血痕预检验方法和潜隐血指掌纹显现方法，为实际案件中联苯胺试验后的血痕DNA检验提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本

一名女性志愿者提供的外周静脉血2mL，EDTA抗凝，于采集血样后1h内，分别吸取1μL滴于血样采集卡（天津诺维莱博科技有限公司）上，室温自然干燥12h，制成滤纸血痕970份，其中对照组10份，实验组960份。

1.2 联苯胺试验

采用血痕预检验试剂盒（北京布兰特警用装备有限公司）对血痕进行联苯胺试验。顺序加入试剂盒内的A（冰醋酸）、B（四甲基联苯胺乙醇饱和溶液）、C（3%过氧化氢溶液）3种液体各10μL。

1.3 DNA提取

对照组10份滤纸血痕不进行联苯胺试验，直接采用Chelex-100 DNA提取纯化试剂盒（天津诺维莱博科技有限公司）提取DNA。

将实验组960份滤纸血痕分成16组，每组60份。1～8组采用Chelex-100 DNA提取纯化试剂盒提取DNA，即Chelex-100法；9～16组采用硅珠提取纯化DNA试剂盒（天津诺维莱博科技有限公司）提取DNA，即硅珠法。两种方法的8组样本分为4个亚组，提取前的处理分别为联苯胺试验（顺序加A、B、C液）、只加A液、只加B液、只加C液。加完液体后又分为立即提取DNA和室温通风干燥1 h后再进行DNA提取。

两种商品化试剂盒的操作方法参照说明书进行，Chelex-100法加入 Chelex-100悬液量为 100 μL，硅珠法洗脱液用量为20μL。

1.4 复合扩增及分型检验

取模板 DNA 1μL，采用 AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR扩增试剂盒（美国AB公司，含有15个STR基因座）进行扩增，体系为10 μL，在9700型PCR仪（美国AB公司）上进行扩增，热循环参数按照试剂盒说明书进行，循环数为28次。以9947A和去离子水为阳性和阴性对照。扩增产物用3500xl基因分析仪（美国AB公司）进行检测，采用GeneMapperTMID-X v1.3软件分析数据。STR基因座检出的标准为：基因座能正确分型，谱峰清晰，判型准确，峰值大于150RFU，杂合子两个峰高比例大于70%，无丢峰，无或少杂峰等干扰判型的因素[5]。

1.5 统计分析

采用SPSS 19.0软件对实验数据进行处理。各组STR基因座检出数的比较采用独立样本t检验，检验水准 α=0.05。

2 结 果

2.1 STR基因座检出数的比较

各组样本的STR基因座检出情况见表1。

对照组采用Chelex-100法提取DNA，获得完整15个STR基因座分型结果。

联苯胺试验和只加A液后立即采用Chelex-100法提取DNA，均未获得STR分型结果，STR基因座检出数低于其余14组（P〈0.05）；联苯胺试验干燥后行Chelex-100 法提取 DNA，获得（4.70±1.96）个 STR 基因座，STR基因座检出数高于联苯胺试验后立即行硅珠法提取 DNA［（3.80±1.34）个 STR 基因座，P〈0.05］，但低于联苯胺试验干燥后行硅珠法提取DNA［（12.90±1.49）个STR基因座，P〈0.05］和加A液后立即行硅珠法提取DNA［（9.40±2.09）个 STR 基因座，P〈0.05］；联苯胺试验干燥后行硅珠法提取DNA有13例（21.7%）获得完整15个STR基因座分型结果，且其STR基因座检出数均高于其余获得部分STR基因座的实验组（2、9、11 组，P〈0.05），但均低于获得完整 15 个 STR 基因座分型结果的实验组（4～8、12～16 组，P〈0.05）。

2.2 案例应用

某年2月26日21：23，在某村一出租屋内发生一起两人被杀死一人被捅伤的恶性案件。嫌疑人在作案后从卧室窗户逃走时，在窗沿上留下了一枚潜血指纹。经联苯胺试验显现，提取到了一枚具有比对条件的残缺指纹，并在指纹库中比中了龚某，成功锁定了嫌疑人。为了增加案件证据的强度，对血指纹上的血迹进行了提取，采用硅珠法提取潜隐血的DNA，成功获得了单一女性的DNA分型结果，并与女死者的DNA分型结果一致，为案件的起诉提供了强有力的证据支撑。

表1 各组样本的STR基因座检出情况 （n=60）

3 讨 论

联苯胺试验除用于血痕预检验外，还常用于现场潜隐血指掌纹的显现。但联苯胺试验对血痕DNA具有较大的破坏作用[4]，在进行潜隐血指掌纹检验时，较难决定采用联苯胺试验显现潜隐血指掌纹和直接提取潜隐血指掌纹上血痕的先后顺序。如果先行联苯胺试验显现指掌纹有可能会影响血痕的后续STR分型检验，如果先行指掌纹上血痕的提取，必然会损坏指掌纹的显现。因此，进一步评估联苯胺试验及相关试剂对现有DNA提取方法和STR分型检验的影响程度具有重要的意义。

本研究比较了联苯胺试验及相关试剂对不同DNA提取方法的提取效率及STR分型检验的影响。研究结果显示：联苯胺试验后立即进行检验，硅珠法的STR基因座检出数高于Chelex-100法，但均未获得有效的DNA分型结果。进行干燥处理后再行检验，两种方法的STR基因座检出数均有大幅度提升，特别是硅珠法有21.7%的样本获得了完整15个STR基因座分型结果，其余的最少也获得了10个STR基因座分型结果，已经能够满足现有DNA数据库比对及个体识别的需要。这表明联苯胺试验中的试剂不仅会损伤血痕中的DNA片段，其中的易挥发试剂还会对DNA提取效率产生较大的影响。进一步比较联苯胺试验中3种试剂单独对STR分型检验的影响，结果显示：单独加入A液后立即检验会对后续的STR分型检验产生显著影响，但加入A液后干燥处理及单独加入B、C液对后续的DNA检验均无显著影响。表明A液对DNA提取效率会产生主要的影响，其原因可能为：A液（冰醋酸）呈弱酸性，顺序加入A、B、C液或A液后会使DNA提取体系呈酸性，在酸性环境中，Chelex-100树脂鳌合金属离子的能力降低或丧失，不能有效防止核酸酶对DNA的降解作用，酸性环境也会大幅减弱硅珠对DNA片段的吸附能力，从而降低DNA的提取效率。单独加入A液后室温通风干燥1h再进行检验，两种方法均能获得完整15个STR基因座分型结果，表明冰醋酸已挥发完全，不再对DNA提取体系产生影响，DNA的提取效率也得到了恢复。

本研究结果还表明：单独加入B、C液不会对血痕DNA片段产生显著损伤，也不会对DNA提取及后续STR分型检验产生显著的影响，但顺序加入A、B、C液干燥处理后进行检验，硅珠法的STR基因座检出数远低于对照组，Chelex-100法的检验结果更是无法应用于实际。可见，联苯胺试验3种试剂与血痕反应产生的物质可能对血痕中DNA产生了较大程度的损伤或对DNA提取效率产生了影响，在冰醋酸挥发完全后，依旧对后续DNA检验造成较大的影响。联苯胺试验的原理为血红蛋白或血红素的过氧化酶活性使过氧化氢释放出新生态的氧，使无色的四甲基联苯胺氧化成四甲基联苯胺蓝。因此，推测是生成的四甲基联苯胺蓝对血痕中的DNA造成了损伤或者影响了DNA的提取效率，该原理有待进一步研究加以验证。

朱传红等[4]曾对血痕联苯胺试验后DNA含量的变化及对STR分型检验的影响进行研究，结果显示联苯胺试验对后续STR分型影响较大，认为血痕联苯胺试验后不能再进行STR分型检验，本研究结论与其并不一致。原因可能为：（1）其研究中未采用硅珠法提取DNA，不同的DNA提取方法导致DNA提取效率存在差异；（2）两研究中联苯胺试验后放置的时间不同（本研究进行联苯胺试验后室温通风放置1h再进行DNA提取，其研究采用室温放置30min～24h在不同时间段进行DNA提取），可能导致后续的DNA提取及统计数据存在差异；（3）其研究中样本例数偏少（每组仅6例），且未考虑联苯胺试验中每种试剂对DNA提取效率的影响。但朱传红等[4]的研究也发现，不同的DNA提取方法对联苯胺试验处理的血痕进行DNA提取后的DNA含量有着显著的影响，本研究结论与其一致。因此，笔者认为血痕联苯胺试验后进行干燥处理，并采用硅珠法提取DNA，完全可以满足实际案件的需要。

综上所述，联苯胺试验对血痕的后续DNA检验有较大的影响，Chelex-100法不适合联苯胺试验后血痕的DNA检验，联苯胺试验后干燥处理及采用硅珠纯化的方法可有效提升联苯胺试验后血痕的STR基因座检出数，以达到实际案件的需要。本研究仅比对了联苯胺试验及相关试剂短期（立即检验和室温干燥1 h）对血痕DNA检验的影响，后续将在本研究的基础上，在更多的时间点对联苯胺试验及相关试剂对血痕DNA检验的影响进行研究，并对联苯胺试验影响血痕DNA检验的原理进行深入的探讨。

[1]罗凯，李明谦，曾途.隐性血痕在命案现场中的运用[J].广西警官高等专科学校学报，2007（S1）：61-63.

[2]巴华杰，马骏，朱爱华，等.雨淋外衣上潜在血迹DNA检验 1 例[J].法医学杂志，2010，26（3）：240.

[3]DE ALMEIDA J P，GLESSE N，BONORINO C.Effect of presumptive tests reagents on human blood confirmatory tests and DNA analysis using real time polymerase chain reaction[J].Forensic Sci Int，2011，206（1-3）：58-61.

[4]朱传红，郑道利，倪尧志，等.联苯胺预试验处理血痕后样本 DNA 定量的研究[J].刑事技术，2012（6）：13-16.

[5]巴华杰，林子清，刘亚楠，等.5种免提取试剂盒检验滤纸血痕结果的比较[J].中国法医学杂志，2013，28（1）：49-51.