WNK1基因rs2301880位点多态性与血压钠反应性的家系关联分析

，3

(1 西安交通大学医院内科，陕西 西安 710049； 2 西安交通大学第一附属医院心内科； 3 陕西省人民医院心血管内科)

高盐摄入导致血压升高，而血压对钠的反应性存在个体差异。本课题组前期的研究结果显示,人群盐敏感性的分布存在家庭聚集现象，新近研究显示人群血压对钠钾反应性具有明显的遗传倾向[1-7]。WNK激酶1(WNK1)是一种位于集合管远端肾单位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称为无赖氨酸激酶1[8-11]。研究显示WNK1基因多态性与高血压的发生，以及高血压病人尿钠钾的排泄有关[12-16]，但迄今为止尚未见WNK1基因多态性与血压对高盐干预反应性关系的研究报道。本研究以前期建立的以家系为基础的盐敏感性人群队列作为研究对象，探讨 WNK1基因rs2301880位点多态性与血压对钠干预反应性的关系，为今后探讨盐敏感性的形成机制以及盐敏感性分子标志的筛选提供理论依据。现将结果报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2003年10月-2004年10月在陕西省汉族人群中选择符合条件的126个家系共342例受试者进行研究。入选标准：通过筛查，选择具有正常血压高值或1期高血压(收缩压17.3～21.3 kPa和(或)舒张压11.3～13.3 kPa、无继发性高血压、筛选前1个月内未使用过抗高血压药物)作为先证者进行家系研究；先证者若有至少2个以上子女则要求子女及配偶均参加研究。同胞、子女及配偶无血压要求，但应排除严重的Ⅱ期或Ⅲ期高血压且血压必须低于21.3/13.3 kPa。所有的研究对象年龄应16～60岁。

1.2 基线调查及饮食干预

进行基线资料调查(人口学信息、疾病史、人体测量数据)，后给予饮食干预[17]。首先给予低盐饮食干预：每天摄入3.0 g盐，早餐无盐，午餐及晚餐各1.5 g盐，连用7 d；然后给予高盐饮食干预：每天摄入18 g盐，早餐3.0 g盐，午餐及晚餐各7.5 g盐，连用7 d。饮食干预采取统一管理、集体配餐、集中饮食的方式，配备专门的营养师负责制定食谱、监督食物的加工制作过程。

1.3 血压测量及血压钠反应性

干预前及干预阶段均采用英国(Hawksley & Sons)生产的随机零点血压计测量血压。每次皆测量血压3次，每次间隔30 s，求其平均值。平均动脉压=3/2舒张压+1/3收缩压。最终血压值为随访3 d共9次测量的血压的平均值。将血压对钠的反应性看作连续性变量，分为低盐期血压反应性、高盐期血压反应性。低盐期血压反应性=低盐期血压-干预前血压，高盐期血压反应性=高盐期血压-低盐期血压。

1.4 DNA的提取和基因分型

严格地按照ReadyAmpTM基因组DNA纯化系统试剂盒进行操作提取白细胞DNA，WNK基因rs2301880位点上游引物为F:5′-TAACTGGAAGGAGACACTTATG-3′，下游引物为R：5′-CTAGACTGGCAATTGTGTCCC-3′。PCR反应体系总体积为15 μL，其中包括10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L的MgCl21.5 μL,10 mmol/L的dNTP 0.4 μL,10 pmol/L上游引物0.25 μL，10 pmol/L下游引物0.25 μL，DNA模板1.5 μL，5×106U/L rTaq 酶0.2 μL。扩增循环参数：94 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。扩增完毕后，在30 g/L的琼脂糖凝胶上电泳以确定PCR产物。 连接酶链反应(LDR)行SNP位点检测, 引物以及LDR探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 荧光探针设计：C：TTTTTTT-TTTTTACTTTGTGTTGCCTTGATTCCTTCC；T：TTTTTTTTTTTTTTTACTTTGTGTTGCC-TTGATTCCTTCT；S4-TR：-P-TTTGGAGGAGT-TGTCTATATAATAATTTTTTTTT-FAM。取1 μL连接产物，加10 μL上样buffer(已混入Mar-ker)，95 ℃变性3 min，立即冰水浴。采用ABI 3730型测序仪得到分型结果。应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。根据峰的大小读取结果。

1.5 统计分析

群体基因型频率分布采用遗传平衡吻合度χ2检验以判定是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。应用FBAT 2.0.2软件进行以家系为基础的相关性检验(FBAT)，分析WNK1基因rs2301880位点多态性与血压钠反应性之间的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 受试者血压对钠饮食干预的反应性

低盐饮食可使受试者的血压下降，而高盐饮食则使血压升高。同时先证者较同胞、配偶及子女等血压变化幅度大。见表1。

表1 受试者血压对盐干预的反应性

2.2 WNK1基因rs2301880位点基因型和等位基因频率分布

由于本研究基于家系人群进行的研究，故选取186名父母亲受试者的基因型进行了Hardy-Weinberg平衡检验。经χ2检验，χ2=0.029，P>0.05，说明选择的WNK1基因rs2301880位点基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示该样本来自一个遗传平衡的总体。

2.3 WNK1基因rs2301880位点与血压的钠反应性之间的关联性

本实验通过LDR-PCR测序分型方法对WNK1基因 rs2301880位点行基因分型，通过FBAT2.0.2软件对WNK1基因rs2301880位点与钠反应性这一数量性状表型进行分析以后发现，rs2301880位点与高盐期血压反应性密切相关，分别与收缩压(Z=1.958,P<0.05)、舒张压(Z=2.228,P<0.05)以及中心动脉压(Z=2.195,P<0.05)均有关系，但与低盐期血压反应性无关。见表2。

表2WNK1基因rs2301880位点与饮食钠干预血压反应性间的关系

时间等位基因收缩压反应性Z值P值舒张压反应性Z值P值中心动脉压反应性Z值P值低盐期C/T-1.1420.2530.4730.6361.2860.198高盐期C/T 1.9580.0462.2280.0252.1950.028

3 讨 论

本研究基于家系连锁关联分析显示，人群对盐负荷后血压变化的个体性差异即血压钠反应性与WNK1基因多态性位点rs2301880有关，提示WNK1基因的变异可能参与了盐敏感性高血压的形成。

WNK1是一种位于集合管远端肾单位丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，又称之为无赖氨酸激酶1。人类WNK1基因位于12p13.3，其编码的序列全长为7 149 bp，由28个外显子组成，编码共2 382个氨基酸，产生相对分子质量约为250 000的蛋白质。WNK1基因于2000年为由XU等[9]首先在大鼠脑组织cDNA文库中发现的一种新的MEK激酶家族成员，由于其催化结构域中缺乏在其他激酶高度保守的赖氨酸残基，而得名With No K kinase(K为赖氨酸缩写)，缩略为WNK1[9-11]。近年来研究显示，WNK1基因参与肾脏的钠钾转运过程，在高血压的形成过程中发挥重要的作用。WILCON等[11]研究显示，WNK1基因第一内含子大片段缺失41 000 bp(736018～777314)和22 000 bp(745978～767784)后可致常染色体显性遗传病GORDON综合征形成。

人群WNK1基因多态性与高血压的发生以及血压对饮食钠钾的反应也有着密切的关系。NEWHOUSE等[14]对英国712个高血压家系进行研究发现，WNK1基因rs1468326位点多态性与收缩压以及舒张压有关联；TOBIN等[15]检测欧洲250个高血压家系共996例受试者的24 h动态血压发现，WNK1基因rs880054多态性位点携带C等位基因的受试者，收缩压以及舒张压分别下降0.18 kPa和0.15 kPa；PERSU等[16]通过BELHYPGEN多中心队列研究发现，WNK1基因多态性与高血压发生相关。同时有研究提示，WNK1基因的多态性可能与钠钾对血压的影响有关。英国学者NEWHOUSE等[18]采用病例对照研究3 400例受试人群发现，有多个WNK1基因多态性位点与收缩压、舒张压相关，10个多态性位点与24 h尿钾排泄量有关，且尿钾与血压呈负相关；日本学者OSADA等[19]研究显示，健康受试者WNK1基因rs880054、rs956868和rs12828016位点不仅与血压相关，且与尿Na/K比值有明显关联。然而这些研究大多采用病例-对照研究方法进行研究，易受到不同种族、地域之间基因型和等位基因频率等所造成的偏倚和混杂因素的影响，同时这些研究中仅是通过尿钠钾含量与血压进行相关分析得到血压对钠钾的反应性，未对样本人群进行饮食干预，因此不能有力地证实WNK1基因多态性与血压对钠钾反应性之间的关系。本研究基于家系进行研究避免了人群混杂和分层偏倚，关联分析包含了家系内部和家系之间相关信息，这对于多重假设检验有重要意义。其次本研究通过进行规范的7 d低盐-7 d高盐饮食干预，严格控制了饮食钠摄入量，以饮食干预后血压变化量来衡量血压对钠的反应性，方法更为准确客观。本实验结果显示，WNK1基因多态性位点rs2301880与盐干预后的血压变化有明显的关联，这进一步证实WNK1基因在肾脏钠钾代谢中的作用，并提示其可能在盐敏感性形成和机制中发挥重要作用。

总之，本研究基于家系和饮食干预试验基础上发现WNK1基因多态性与血压对钠干预反应性有关，结果提示WNK1基因可能参与盐敏感性形成，同时也可能成为新的盐敏感性分子遗传标志，但仍有待于今后更进一步的试验证实。

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