铜对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及肝功能和免疫功能的影响

(1 青岛大学公共卫生学院，山东 青岛 266021； 2 青岛市标准化研究院)

铜是一种非常重要的微量元素。它不仅参与蛋白质、核酸、脂肪、碳水化合物、维生素等营养物质的代谢，而且在人体骨骼发育、生殖、凝血等生理功能中起着重要的作用。然而，环境重金属污染已成为全球问题，环境铜污染也日趋严重。铜是工业中常用的重金属，一项对电子垃圾拆除中心周围居住人群的血清铜和尿铜的研究检测结果显示，暴露组人群和对照组人群的血清铜和尿铜水平均有显著差异[1]。同时，铜具有的促生长和杀菌作用，使得人们在畜牧业和农业上大量使用铜相关制剂[2-4]。铜蓄积或代谢异常可以导致WILSON病[5]和MENKE病[6]，铜过载与神经性疾病如阿尔茨海默病(AD)等疾病的发生也有关系[7-8]。近年来，随着肿瘤研究的深入，铜与肿瘤的关系也逐渐成为人们关注的焦点，铜可能是影响人类肿瘤生长的重要因素。临床流行病学调查显示，部分癌症病人血清铜含量明显高于健康人群，与肿瘤的发生间存在着相关性，如口腔癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌和脑瘤等[9-14]，并且适量的铜缺乏是能够抑制肿瘤发生的[15-16]。本实验在前期细胞实验研究的基础上，通过建立H22荷瘤小鼠的模型，选择适量的铜浓度给小鼠灌胃，观察铜对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及肝功能和免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物来源及分组

SPF级昆明小鼠80只，体质量18～22 g，购于山东鲁抗药业公司(许可证号scxk(鲁)20140007)。适应性喂养1周后，按照体质量随机分为灌胃给水组(A组)，灌胃给水+四硫钼酸铵盐(TM)组(B组)，分别灌胃给予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸铜组(C、D、E组)，分别灌胃给予0.06、0.3、1.5 mg/kg硫酸铜+1 mg/kg TM组(F、G、H组)，每组10只小鼠，小鼠每日自由进水、进食。

1.2 各组处理与模型制备

根据上述的分组，用不同浓度的硫酸铜溶液给小鼠灌胃4周，使小鼠体内获得一定量的铜蓄积。随后，将H22腹水瘤细胞接种于小鼠右腿部，建立H22肝癌小鼠移植瘤模型(抽取H22腹水瘤小鼠的腹水，在显微镜下通过锥虫蓝染色计数(>95%)，通过PBS将细胞数调至1×109/L。随后，以每只5×109个细胞/L接种在小鼠的右后腿)。然后，根据相应的分组及硫酸铜继续持续灌胃4周。9周后，将全部小鼠处死，眼球取血。取出移植瘤及肝、脾、胸腺等脏器并称量。

1.3 观察指标及测定方法

1.3.1肿瘤发生情况及体积变化 在接种肿瘤后，每3 d测量一次肿瘤的长和宽并记录，根据公式计算瘤体积(V)，公式如下：V=长×宽×宽/2。

1.3.2肝功能及脾脏和胸腺指数计算 实验结束后，小鼠禁食12 h。眼球取血后，取小鼠的胸腺和脾脏并称量，通过公式计算出小鼠的胸腺和脾脏指数。公式如下：胸腺指数=胸腺质量/(小鼠体质量×10)，脾脏指数=脾脏质量/(小鼠体质量×10)

1.3.3ICP-MS检测血清铜的含量 取血清0.2～0.5 g。将试样置于聚四氟乙烯消解罐中，然后加入6 mL硝酸，再加入1 mL过氧化氢，盖上密封盖，放入微波消解仪中消解，程序为升温至200 ℃，后加热时间10 min,控制温度200 ℃，持续时间20 min，冷却时间30 min。随后按照仪器操作规程，调整仪器至最佳状态。待仪器稳定后，按顺序依次对标准溶液、空白溶液和试样进行测定。所得结果按照以下公式进行计算：X=c×10/m×1000 (X:铜含量，c:当前试样铜浓度，m: 试样质量)。

1.4 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测肿瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA的表达

利用Trizol提取肿瘤组织中的mRNA，用痕量核酸仪检测mRNA的浓度和纯度。随后用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，然后用PCR仪检测VEGF和bFGF的表达。检测条件如下：95℃预变性5 min；然后95℃变性10 s,60 ℃退火30 s，共进行50个循环。引物序列：bFGF F：5′-ACGG-CTGCTGGCTTCTAAGT-3′，R：5′-CAGTGCCA-CATACCAACTGGA-3′；VEGF F：5′-CACCAAA-GCCAGCACATAGG-3′，R：5′-ACCCTTTCCCTT-TCCTCGAA-3′。

2 结 果

2.1 各组H22荷瘤小鼠体质量及肿瘤的生长变化

实验结束后，A、B、C组和F组各有1只小鼠死亡，D组中有2只小鼠死亡，E组和H组中有3只小鼠死亡，G组中有4只小鼠死亡。实验结果显示，与A、F、G、H组相比，D、E组肿瘤均有不同程度的增长，差异具有显著意义(F=9.034，P<0.05)。见表1。

2.2 各组小鼠肝功能指标及胸腺、脾脏指数比较

各组小鼠AST、ALT、ALB及胸腺指数、脾脏指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 各组小鼠血清铜水平

A～E组血清铜水平分别为(1.43±0.20)、(1.39±0.17)、(1.55±0.22)、(1.64±0.48)、(1.92±0.27)、(1.51±0.35)、(1.23±0.15)、(1.51±0.35)mg/kg，E组血清铜水平与A组相比显著增高，差异有显著性(F=3.803,P<0.05)。

2.4 血清铜与肿瘤质量的相关性分析

随机抽取32例血清样本，检测结果显示，血清铜的水平平均为(1.51±0.35)mg/kg，肿瘤质量平均为(3.84±1.11)g，血清铜水平与肿瘤质量具有相关性(r=0.316，P<0.05)。

2.5 各组小鼠肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA表达水平比较

A～E组肿瘤组织中VEGF mRNA的相对表达水平分别为0.29±0.004、0.02±0.001、0.26±0.011、0.34±0.012、0.39±0.016、0.06±0.046、0.01±0.001、0.01±0.001；A～E组小鼠肿瘤组织中bFGFmRNA表达水平分别为0.28±0.016、0.02±0.001、0.15±0.007、0.25±0.051、0.92±0.27、0.02±0.014、0.04±0.003、0.01±0.001。C、D、E组与A组相比，肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA表达水平升高，差异有显著性(F=40.118、197.090,P<0.05)。

表1 各组H22荷瘤小鼠体质量及瘤质量的变化

表2 各组小鼠肝功能指标及胸腺、脾脏指数比较

3 讨 论

肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。根据全国第3次死因回顾性调查发现，恶性肿瘤中，原发性肝癌引起的死亡人数已从第3位升高到第2位[17]，严重危害着我国居民的健康，给人类造成了巨大的疾病负担。

肝癌的发生是多因素、多途径、多步骤长期作用的结果，但病因机制尚未完全阐明，肝癌的预防仍然是临床上的难题。肝脏作为铜蓄积的主要器官，当铜的蓄积超过肝脏代谢的阈值时，会损害肝细胞，引起多种疾病，如WILSON病[5]和MENKE病[6]。铜过量可引起细胞发生氧化应激，从而产生活性氧(ROS)，ROS可以造成脂质、蛋白质和DNA损伤。ROS同时也是导致肿瘤发生和发展的重要因素[18]。研究显示，肝对铜负载会启动自身的保护机制，即使没有发生临床、生化和形态上的变化，肝细胞中HGFb和NF-κB的表达也会增加，进而增加肝损伤的风险[19]。以往有关铜的研究多是选择超过机体可承受范围多倍的铜浓度，用以观察高铜对动物的毒性作用；而有关机体可承受的铜浓度对机体的作用主要集中在体外细胞系的研究。但是，人类在现实生活中接触高浓度铜的机会却很少。所以本实验研究所采用的铜和TM的剂量，是根据中国营养学会(CNS)建议的成人铜的适宜摄入量(AI)为2 mg/d，最高可耐受摄入量(UL)为8 mg/d计算出来的。当成人每日摄入0.8～7.5 mg铜时，机体中的血浆铜浓度、红细胞超氧化物歧化酶、血浆铜蓝蛋白和尿铜无明显变化[20]；当机体摄入1 mL的TM时，可以降低人体20%的血铜，既有效地抑制促血管发生因子的释放，又不会对机体产生副作用，机体也能长期耐受[21]。本实验结果显示，各组小鼠肝功能血清理化指标间比较差异无统计学意义，说明本实验所选用的铜和TM的浓度在实验周期内未对小鼠的肝脏和免疫系统造成损伤。

多数肿瘤的生长需要铜离子的参与[22]，长期饮用高铜浓度(公众供水系统中规定的最高含量)的水能加速癌细胞的生长[23]。这些研究提示，铜可能是影响肿瘤生长的重要因素。肿瘤细胞的高增殖速率相比于正常形态功能的细胞来说，需要更多的铜离子来满足其对生长、增殖所需的环境条件要求。本实验结果显示，随着铜浓度的升高，H22荷瘤小鼠的肿瘤的大小和体积也随之增加，呈剂量反应关系；血清铜水平也随铜浓度的增加而升高，并与肿瘤质量具有相关性，这与铜和乳腺癌关系的研究结果相一致[24]。

肿瘤生长需要许多因素的参与，肿瘤中血管的生成也是肿瘤生长的众多重要因素之一。肿瘤细胞不仅能够分泌血管生长因子，而且能够促进肿瘤血管内皮细胞的增殖。肿瘤血管是由血管生成因子的释放所介导的，血管生成因子主要包括VEGF、bFGF和TGF等，其中，VEGF是被认为最重要的血管生成因子[25]，VEGF信号通路在血管生成的全过程中发挥不可替代的作用。已有的研究表明，在血管生成的过程中，VEGF通过多种途径参与肿瘤的生长、转移等[26-27]。bFGF是最强的肿瘤血管生长因子，其异常表达可促进细胞增殖、恶性转化以及肿瘤形成[28]。为了深入探讨铜和TM对H22移植瘤中VEGF和bFGF的影响，本实验采用RT-PCR方法检测了肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA的表达水平，结果显示，随着铜浓度的增加，肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA表达有了明显的上调，而加入TM组肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA的表达逐渐降低。这一结果与RIGIRACCIOLO等[22]的研究一致。

综上所述，本实验通过建立H22荷瘤小鼠模型，在铜和TM的作用下观察肿瘤的生长情况。实验结果表明，铜能够促进肿瘤的生长，其机制可能是通过上调肿瘤组织中VEGF和bFGF mRNA的表达，从而达到促进肿瘤细胞增殖的作用，但仍需要进一步的深入研究。本实验结果为肝癌的预防提供了参考，同时也为防治铜污染提供了证据。

[参考文献]

[1] 刘志辉,杨伟萍,韦长元,等. 微量元素锌、铜、锰与硒在原发性肝癌组织和血清中的含量及相关性研究[J]. 广西医科大学学报, 2016,33(1):66-70.

[2] ARRUDA L F, ARRUDA S F, CAMPOS N A, et al. Dietary iron concentration may influence aging process by altering oxidative stress in tissues of adult rats[J]. Plos One, 2013,8(4):e61058.

[3] 韩尽斌,曲毅,徐新春,等.抗肿瘤铜配合物研究进展[J]. 现代中西医结合杂志2014 (18):2034-2037.

[4] HAIQUAN L, DEBANGSHU S, LISHA X, et al. Chemotherapy triggers HIF-1-dependent glutathione synthesis and copper chelation that induces the breast cancer stem cell phenotype[J]. P Natl Acad Sci USA, 2015,112(33):4600-4609.

[5] STOCKAK, REUNER U, GOHILK, et al. Effects of copper toxicity on response inhibition processes: a study in Wilson’s disease[J]. Arch Toxicol, 2016,90(7):1623-1630.

[6] YOGANATHANS, SUDHAKARSV, ARUNACHALG, et al. Menkes disease and response to copper histidine: An Indian case series[J]. Ann Indian Acad Neur, 2017,20(1):62-68.

[7] SQUITTI R, VENTRIGLIA M, GENNARELLI M. Non-Ceruloplasmin Copper Distincts Subtypes in Alzheimer’s Disease: a Genetic Study of ATP7B Frequency[J]. MolNeurobiol, 2016,54(1):671-681.

[8] AVAN A, HOOGENRAAD T U. Zinc and Copper in Alzheimer’s Disease[J]. J Alzeimers Dis, 2015,46(1):89.

[9] DENOYER D,PEARSON H B,CLATWORTHY S A, et al. Copper as a target for prostate cancer therapeutics: coppe-rionophore pharmacology and altering systemic copper distribution[J]. Oncotarget, 2016,7(24):37064-37080.

[10] SETHURAMAN R. P0007 Estimation of serum iron and se-rum copper in oral precancer, cancer and healthy individuals: A comparative study-European Journal of Cancer[J]. Eur J Can-cer, 2014,50(4):e11.

[11] SOHRABIM, GHOLAMIA, AZAR M, et al. Trace element and heavy metal levels in colorectal cancer: comparison between cancerous and non-cancerous tissues[J]. Biol Trace Elem Res, 2017(22):1-8.

[12] JAMLOSM, ISMAILA, JAMLOSM. Hybrid graphene-copper UWB array sensor for brain tumor detection via scattering parameters in microwave detection system[J]. Applied Physics A, 2017,123(1):112-123.

[13] SINGH B P, DWIVEDI S, DHAKAD U, et al. Status and interrelationship of zinc, copper, iron, calcium and selenium in prostate cancer[J]. Indian J of Clinical Bioc, 2016,31(1):50-56.

[14] SHEN F, CAI W S, LI J L, et al. The association between serum levels of selenium, copper, and magnesium with thyroid cancer: A meta-analysis[J]. Biol Trace Elem Res, 2015,167(2):225-235.

[15] KHOSHDEL Z, NAGHIBALHOSSAINI F, ABDOLLAHI K, et al. Serum copper and zinc levels among iranian colorectal cancer patients[J]. Biol Trace Elem Res, 2016,170(2):294-299.

[16] ANTONIADESV, SIOGA A, DIETRICHCE, et al. Is copper chelation an effective anti-angiogenic strategy for cancer treatment[J]? Med Hypotheses, 2013,81(6):1159-1163.

[17] 刘军. 微量元素铜和锌在实验性肝癌中的变化及意义[J]. 医药前沿, 2017,7(33):165-166.

[18] 熊珊珊,石英英,石汉平. 活性氧与肿瘤研究进展[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2014,21(13):1045-1048.

[19] ARAYA M, NUNEZ H, PAVEZ L, et al. Administration of high doses of copper to capuchin monkeys does not cause liver damage but induces transcriptional activation of hepatic proli-ferative responses[J]. J Nutr, 2012,142(2):233-237.

[20] 刘志辉,杨伟萍,韦长元,等. 微量元素锌、铜、锰与硒在原发性肝癌组织和血清中的含量及相关性研究[J].

广西医科大学学报, 2016,33(1):66-70.

[21] FERNANDES A S, FLóRIDO A, SARAIVA N, et al. Role of the copper(Ⅱ) complex Cu [15] pyN5 in intracellular ROS and breast cancer cell motility and invasion[J]. Chem Biol Drug Des, 2015,86(4):578-588.

[22] RIGIRACCIOLO D C, SCARPELLI A, LAPPANO R, et al. Copper activates HIF-1α/GPER/VEGF signalling in cancer cells[J]. Oncotarget, 2015,6(33):34158-34177.

[23] ISHIDA S, ANDREUX P, POITRYYAMATE C, et al. Bioavailable copper modulates oxidative phosphorylation and growth of tumors[J]. P Natl Acad Sci USA, 2013,110(48):19507-19512.

[24] PAVELA M, UITTI J, PUKKALA E. Cancer incidence among copper smelting and nickel refining workers in Finland[J]. Am J Ind Med, 2017,60(1):87-95.

[25] WANG Z, HUANG P, JACOBSON O, et al. Biomineralization-Inspired Synthesis of Copper Sulfide-Ferritin Nanocages as Cancer Theranostics[J]. Acs Nano, 2016,10(3):3453-3460.

[26] LIU P, BROWN S, CHANNATHODIYIL P, et al. Reply: Cytotoxic effect of disulfiram/copper on human glioblastoma cell lines and ALDH-positive cancer-stem-like cells[J]. Brit J of Cancer, 2013,108(4):993-993.

[27] FERRARAN.Vascular Endothelial Growth Factor [J]. Eur J of Cancer, 2013,32(14):274-276.

[28] FARHAN M, KHAN H Y, OVES M, et al. Cancer therapy by catechins involves redox cycling of copper ions and generation of reactive oxygen species[J]. Toxins, 2016,8(2):37-39.