高产几丁质酶菌株的 诱变选育及发酵条件的优化

郑家敏,梁燕辉,朱 凡,叶秀云,林 娟

(福州大学,福建省海洋酶工程重点实验室,福建福州 350116)

几丁质(chitin)又称甲壳素或壳多糖,是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和少量D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性多糖[1]。几丁质在自然界中储量巨大,是仅次于纤维素的可再生资源,主要来源于海洋中的虾蟹壳[2]。

几丁质酶(chitinase,EC3.2.1.14)是一类能特异性催化几丁质水解生成几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖的酶。1905年,Benecke首次发现贝内克氏菌(Beneckeachitinovora)具有降解几丁质的能力[3],之后科学家相继发现细菌、真菌、放线菌也能通过合成几丁质酶来降解几丁质作为自身能量来源,一些动植物和病毒在生长特殊时期也能产生几丁质酶[4-6]。几丁质酶降解几丁质生成的高附加值产物及其衍生物,具有抗菌益菌、降低血糖血脂、抗癌、调节人体pH、增强免疫力等生物活性,在食品、医药、农业、化妆品等行业具有广阔的应用前景[7-9]。

微生物几丁质酶的研究已经取得了一定的进展,但菌株产酶量低且不稳定限制了几丁质酶的生产应用。目前,国内外学者用来提高几丁质酶活力的方法大多可分为传统诱变育种技术、

基因工程技术和基因重排技术。传统诱变育种技术包括物理和化学诱变。研究发现,使用紫外线、X射线、微波辐射、激光、离子束等物理方法均可取得良好的诱变效果,具有设备简单、操作方便、安全快速等优点,但是长期重复使用会导致诱变率降低和抗饱和性[10]。化学诱变的优点是突变频率较高,但诱变剂量过高会有一定毒性,因此会采用物理-化学联合的方法来达到预期的诱变效果。田强等[11]通过UV-LiCl复合诱变获得一株几丁质酶变异株TUC13,发酵条件优化后酶活提高了236.5%,酶活力为0.11 U/mL。张敏等[12]通过紫外线、氯化锂、硫酸二乙酯的复合诱变,获得了1株遗传稳定的高产几丁质酶活性菌株,优化后酶活力提高到了1.53 U/mL,较出发菌株提高了347.7%。

本文通过紫外-LiCl和微波-LiCl两轮复合诱变以及发酵条件优化来提高菌株的产酶能力,为几丁质酶的开发应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)G3-1 从海洋中分离获得;粘质沙雷氏菌GF-21 紫外-LiCl和微波-LiCl复合诱变后的突变株;细粉几丁质 Sigma公司;胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉(BR) 上海生物工程有限公司;其余试剂 均为国产分析纯。

U-2910分光光度计、CF16RXⅡ型高速冷冻离心机 日本HITACHI公司；78-1型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；SW-CJ-2F I类B型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；WP800TL23-K3微波炉 广东格兰仕集团有限公司；UB-7型pH计 赛多利斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 筛选培养基:2%(w/v)胶体几丁质500 mL,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,MgSO40.5 g,FeSO4·H2O 0.02 g,NaCl 5 g,蛋白胨3 g,蒸馏水定容至1000 mL,pH7.0～7.2,121 ℃,20 min灭菌;

种子培养基:蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,蒸馏水定容至1000 mL,pH7.0～7.2;

基础发酵培养基[13]:2%(w/v)胶体几丁质500 mL,蛋白胨10 g,K2HPO40.7 g,KH2PO40.3 g,MgSO40.5 g,FeSO4·H2O 0.02 g,NaCl 5 g,蒸馏水定容至1000 mL,pH7.0～7.2。

1.2.2 出发菌株G3-1生长曲线的测定 将菌株G3-1经活化后转接于种子培养基中,30 ℃、200 r/min培养,每隔2 h取菌液测定OD600并记录。

1.2.3 几丁质酶活力的测定

1.2.3.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取0.2 g烘干至恒重的N-乙酰-D-氨基葡萄糖,用蒸馏水定容至100 mL,再取出10 mL定容至100 mL,配制成终浓度为0.2 mg/mL的N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准溶液,采用DNS法测定[9,14],按表1加入试剂,混匀后沸水浴5 min,冷水冷却至室温,在540 nm下测定吸光值,根据吸光值与质量的关系绘制标准曲线,得到回归方程为y=5.3327x-0.0656,R2=0.9991。

表1 N-乙酰基-D-氨基葡萄糖标准曲线绘制Table 1 The standard curve of N-Acetyl-D-glucosamine

1.2.3.2 酶活力的测定 采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定还原糖含量[9,14]。取0.1 mL酶液与0.9 mL的0.5%胶体几丁质底物,于50 ℃水浴反应30 min后,加入1.5 mL DNS终止反应并煮沸5 min显色;同时以灭活酶液组作为空白对照。6000 r/min离心5 min,取上清液于540 nm测定吸光值,根据N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线计算还原糖含量。酶活力单位定义为:在该反应条件下,1 min催化底物产生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量作为1个酶活力单位(U)。

1.2.4 紫外-LiCl复合诱变 取对数生长期菌液离心(10000 r/min,5 min)后,沉淀用生理盐水稀释成浓度为108个/mL的菌悬液。将装有5 mL菌悬液的无菌平皿置于磁力搅拌器上,在实验前打开紫外灯预热10 min,在距离紫外灯(15 W)30 cm处进行诱变。分别照射0、3、6、9、15、30、45 s,每个照射时间各取0.1 mL处理后的菌液涂布于筛选平板上,30 ℃避光培养5 d,计算致死率,确定最佳紫外照射时间[11]。

致死率(%)=(未经诱变处理菌落数-诱变处理后菌落数)/未经诱变处理菌落数×100

式(1)

将经过紫外诱变后的菌悬液涂布在含有0.5% LiCl的筛选平板上,置于30 ℃培养。

1.2.5 微波-LiCl复合诱变 以紫外-LiCl复合诱变的突变株G-12作为微波诱变的出发菌株。将装有5 mL菌悬液的无菌试管置于微波炉中进行诱变处理,微波辐射采用高档火(最大功率700 W,微波波段2450 MHz),分别辐射0、15、30、45、60、75、90、120、180 s,并每隔3 s用冰浴法消除热效应。每个辐射时间分别吸取0.1 mL处理后的菌悬液涂布于筛选平板上,30 ℃培养5 d,根据公式(1)计算致死率,确定最佳微波辐射时间[15]。

将经过微波诱变后的菌悬液涂布在含有0.5% LiCl的筛选平板上,置于30 ℃培养。

1.2.6 培养基成分对突变株GF-21产酶的影响 培养基初始pH7.0,温度30 ℃,摇床转速200 r/min,接种龄8 h,接种量8%,在此发酵条件下,对培养基成分进行优化。

1.2.6.1 碳源对产酶的影响 在基础发酵培养基中分别添加5 g/L的环糊精、淀粉、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、糯米粉、马铃薯淀粉、麸皮作为碳源,以基础发酵培养基作为对照组,研究不同碳源对GF-21产酶的影响,确定最适碳源。

向基础培养基中分别添加1、2、3、4、5、6、7 g/L的乳糖,确定乳糖添加量。

1.2.6.2 氮源对产酶的影响 在添加6 g/L乳糖的基础上,分别以5 g/L的(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4HPO3、NH4NO4、花生饼粉、玉米粉、尿素、蛋白胨、酵母膏取代基础发酵培养基中的氮源,以添加6 g/L乳糖的基础发酵培养基作为对照组,研究不同氮源对GF-21产酶的影响,确定最适氮源[13]。

向基础培养基中分别添加2、4、6、8、10、12、14 g/L的尿素,确定尿素添加量。

1.2.6.3 金属离子对产酶的影响 在添加6 g/L乳糖和8 g/L尿素的基础上,分别添加0.2 mmol/L和1 mmol/L的K+、Ca2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ni+、Zn2+、Cu2+、Mg2+和10 mmol/L的K+、Ca2+,研究不同金属离子对GF-21产酶的影响,确定对产酶促进作用最明显的金属离子。

向基础培养基中分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5 mmol/L的K+,确定K+添加量。

1.2.6.4 其他培养基成分添加量的影响 在添加6 g/L乳糖、8 g/L尿素和0.8 mmol/L K+的基础上,研究作为诱导剂的胶体几丁质添加量(0、2、4、6、8、10、12、14 g/L)以及作为渗透压调节剂的NaCl添加量(1、2、3、4、5、6、7 g/L)对GF-21产酶的影响。

1.2.6.5 培养基成分的优化 在培养基成分单因素实验基础上,选择乳糖、尿素、KCl、胶体几丁质进行4因素4水平L16(45)正交实验[16-17]。正交实验设计表如2所示。

表2 正交实验设计表Table 2 Orthogonal experimental design

1.2.7 发酵条件对突变株GF-21产酶的影响

1.2.7.1 培养基初始pH对几丁质酶合成的影响 分别设置优化后的发酵培养基初始pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,以8%(v/v)接种量,200 r/min发酵培养48 h后测定发酵液酶活,研究不同初始pH对GF-21产酶的影响[12]。

1.2.7.2 发酵温度对几丁质酶合成的影响 培养基初始pH为9.0,以8%(v/v)接种量,200 r/min发酵培养48 h后测定发酵液酶活,研究不同发酵温度(23、25、27、30、33、35、37 ℃)对GF-21产酶的影响。

1.2.7.3 摇床转速对几丁质酶合成的影响 培养基初始pH为9.0,以8%(v/v)接种量,30 ℃发酵培养48 h后测定发酵液酶活,研究不同摇床转速(150、180、200、220、250 r/min)对GF-21产酶的影响。

1.2.7.4 接种龄对几丁质酶合成的影响 培养基初始pH为9.0,以8%(v/v)接种量,30 ℃,200 r/min发酵培养48 h后测定发酵液酶活,研究种子液不同菌龄(3、4、5、6、7、8、9 h)对GF-21产酶的影响。

1.2.7.5 接种量对几丁质酶合成的影响 培养基初始pH为9.0,30 ℃,200 r/min发酵培养48 h后测定发酵液酶活,研究不同接种量(2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%)对GF-21产酶的影响。

1.3 数据处理

实验中每个样品设3个平行,采用Origin 8.0软件作图和SPSS 20.0软件进行数据的显著性分析。

2 结果与分析

2.1 出发菌株G3-1生长曲线的测定

如图1所示,菌株G3-1在4 h后进入对数生长期,10 h后进入稳定期,选择培养8 h后的菌液进行诱变。

图1 菌株G3-1的生长曲线Fig.1 Growth curve of strain G3-1

2.2 紫外-LiCl复合诱变

如图2所示,在3～15 s之间,随着紫外照射时间的延长,致死率迅速增加,15 s后趋于平衡。在以紫外线作诱变剂时,一般采用致死率为80%～85%左右的剂量,因此选择最佳紫外诱变时间为12 s。

图2 菌株G3-1紫外诱变的致死曲线Fig.2 Lethal curve of UV mutation

经紫外-LiCl复合诱变,获得15株酶活明显提高的正突变菌株(表3)。其中突变株G-12产酶能力提高最多,酶活力达到1.41 U/mL,比出发菌株G3-1提高了69.9%。选取4株酶活力有较大提高的突变菌株GU-4、G-12、G-16、GU-17在活化平板上连续传代5次,测定其遗传稳定性。

表3 紫外-LiCl复合诱变突变菌株的几丁质酶活力提高率Table 3 Improvement rate of chitinase activity of strains by UV-LiCl mutagenesis

由表4可以看出,突变株G-12和G-16的遗传稳定性较好,由于在传代实验中G-12的第一代酶活略高些,因此选择突变株G-12作为微波-LiCl复合诱变的出发菌株。

表4 紫外-LiCl复合诱变突变菌株遗传稳定性Table 4 The genetic stability of mutant strains

2.3 微波-LiCl复合诱变

如图3所示,微波辐射时间在0～60 s之间,微波对G-12的影响较小,60 s时致死率仅为15.31%;但在60～75 s之间细菌迅速死亡,这可能是由于微波辐射热效应的积累对G-12影响导致的。最后选择致死率在75%左右的微波辐射时间75 s作为最佳诱变剂量。

图3 G-12微波诱变的致死曲线Fig.3 Lethal curve of microwave mutation

经微波-LiCl复合诱变,获得9株酶活力提高较多的正突变菌株(表5)。选取酶活力提高最多的4株突变株GF-21、GF-25、GF-28、GF-32在活化平板上连续传代5次,测其遗传稳定性,结果如图4所示。4株突变株都有较好的遗传稳定性,结合4株突变株的酶活力,选择酶活力提高率为87.31%的突变株GF-21作为后续研究的实验菌株。

表5 微波-LiCl复合诱变突变菌株的几丁质酶活力提高率Table 5 Improvement rate of chitinase activity of strains by microwave-LiCl mutagenesis

图4 微波-LiCl诱变突变菌株的遗传稳定性Fig.4 The genetic stability of mutant strains

2.4 培养基成分对突变株GF-21产酶的影响

2.4.1 碳源对GF-21产酶的影响 碳源为微生物细胞物质合成提供碳骨架成分,不同碳源对几丁质酶的影响结果表明,以乳糖作为碳源,GF-21的酶活力最高,说明其效果最好(图5),当乳糖添加量为6 g/L时,产酶能力达到最高(图6),因此确定乳糖适宜添加量为6 g/L。

图5 碳源种类对几丁质酶合成的影响Fig.5 Effects of carbon sourceson chitinase production

图6 乳糖添加量对几丁质酶合成的影响Fig.6 Effects of lactose addition on chitinase production

2.4.2 氮源对GF-21产酶的影响 氮源是微生物合成核酸和蛋白质的重要物质,不同氮源对几丁质酶的影响结果表明,尿素对产酶影响最大(图7),当尿素添加量为2～6 g/L时,GF-21产酶能力随着尿素添加量的增加而缓慢增加;当尿素添加量超过12 g/L时,产酶能力迅速下降(图8)。因此确定尿素的添加量为8 g/L。

图7 不同氮源对几丁质酶合成的影响Fig.7 Effects of nitrogen sources on chitinase production

图8 尿素添加量对几丁质酶合成的影响Fig.8 Effects of urea addition on chitinase production

2.4.3 金属离子对GF-21产酶的影响 金属离子参与了细胞内结构物质和某些酶的活性基团的组成,并且影响细胞的跨膜运输方式。结果表明,K+对产酶有较大的促进作用,而Cu2+对产酶几乎100%抑制,Ni+的抑制效果次之,而Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+对GF-21产酶几乎没有影响(图9)。

图9 不同金属离子对几丁质酶合成的影响Fig.9 Effects of different metal ions on chitinase production

选择对产酶促进作用最明显的K+进行添加量实验,结果如图10所示。产酶能力随K+浓度增加而增加,在0.8 mmol/L时GF-21产酶能力最高,之后趋于平衡,故选择K+浓度为0.8 mmol/L。

图10 K+添加量对几丁质酶合成的影响Fig.10 Effects of K+ addition on chitinase production

2.4.4 其他培养基成分添加量对GF-21产酶的影响 胶体几丁质作为GF-21发酵产酶过程中的诱导剂,同时提供碳源和氮源,胶体几丁质添加量对GF-21产酶有较大影响。如图11所示,当胶体几丁体添加量为10 g/L时,GF-21产酶能力达到最高;当胶体几丁质大于12 g/L,GF-21产酶能力下降,因为胶体几丁质浓度太高导致发酵液变得粘稠,不利于溶氧,抑制细菌生长。因此选择胶体几丁质添加量为10 g/L。

图11 胶体几丁质添加量对几丁质酶合成的影响Fig.11 Effects of colloid chitin concentration addition on chitinase production

因出发菌株G3-1来源于海洋,故研究NaCl对其产酶的影响。结果表明,当NaCl浓度为5 g/L时,GF-21产酶能力达到最高,增加或减少NaCl浓度,GF-21产酶能力都下降,因此选择NaCl添加量为5 g/L(图12)。

图12 NaCl添加量对几丁质酶合成的影响Fig.12 Effects of NaCl addition on chitinase production

2.4.5 正交实验 在单因素实验的基础上,选择乳糖、尿素、KCl、胶体几丁质进行4因素4水平L16(45)正交实验,实验结果如表6所示。由极差分析可得各因素对产酶的影响大小为:

表6 L16(45)正交实验结果Table 6 Results of L16(45)orthogonal experiment

D(胶体几丁质)>A(乳糖)>B(尿素)>C(KCl);通过比较K值大小确定最优水平组合为A2B4C3D4,即乳糖6 g/L,尿素10 g/L,KCl 1.0 mmol/L,胶体几丁质10 g/L。在该条件下进行验证实验,酶活力为4.73 U/mL,比优化前提高了109.3%。由方差分析可知(表7),胶体几丁质对产酶影响极显著(p<0.01),其次为尿素和乳糖(p<0.1),KCl影响不显著(p>0.1)。

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance

2.5 发酵条件对突变株GF-21产酶的影响

2.5.1 培养基初始pH对GF-21产酶的影响 当培养基初始pH为4.0～9.0时,GF-21产酶能力逐渐增加;当pH为9.0时,产酶能力达到最高。因此选择培养基初始pH为9.0(图13)。

图13 培养基初始pH对几丁质酶合成的影响Fig.13 Effects of initial pH on chitinase production

2.5.2 温度对GF-21产酶的影响 当温度为25～33 ℃之间时,GF-21产酶能力较高且相对稳定,故选择30 ℃作为最佳发酵温度(图14)。

图14 温度对几丁质酶合成的影响Fig.14 Effects of temperature on chitinase production

2.5.3 转速对GF-21产酶的影响 摇瓶转速影响供氧水平,结果表明,转速为150～220 r/min时对GF-21产酶能力影响不大,但高于220 r/min,产酶能力下降,因此选择摇瓶转速为220 r/min(图15)。

图15 不同转速对几丁质酶合成的影响Fig.15 Effects of rotation speed on chitinase production

2.5.4 接种龄和接种量对GF-21产酶的影响 接种龄和接种量会影响菌体的生长周期,但在该实验中,接种龄和接种量对GF-21产酶无明显影响(图16,图17)。处于对数生长期的菌体生长较快,为了使菌体快速生长达到一定的菌浓度,在后续实验中,选择接种龄为5 h,接种量为10%。

图16 接种龄对几丁质酶合成的影响Fig.16 Effects of inoculation age on chitinase production

图17 不同接种量对几丁质酶合成的影响Fig.17 Effects of inoculum size on chitinase production

3 结论与讨论

本文以产几丁质酶细菌G3-1作为出发菌株,通过紫外-LiCl和微波-LiCl两轮复合诱变,最终获得一株产酶能力高且遗传稳定的突变株GF-21,并对其发酵培养基和产酶条件进行优化。研究结果表明,最优发酵培养基配方为:乳糖6 g/L,尿素10 g/L,KCl 1.0 mmol/L,NaCl 5 g/L,胶体几丁质10 g/L。在该条件下进行验证实验,酶活力为4.73 U/mL,比优化前提高了109.3%,较出发菌株提高了470%。最优发酵条件为:培养基初始pH9.0,温度30 ℃,摇床转速220 r/min,接种龄5 h,接种量10%。

根据已报道的文献,目前几丁质酶活力偏低,限制了几丁质的开发利用。如施腾鑫等[18]从海塘土壤中分离得到一株产几丁质酶的粘质沙雷氏菌菌株,酶活力为1.0 U/mL。王慧敏等[19]对海洋细菌产几丁质酶条件进行优化,优化后的酶活力为0.63 U/mL。陶勇[20]对产几丁质酶细菌发酵条件进行优化,在最优条件下酶活力为2.68 U/mL。Singh等[21]筛选到的Paenibacillussp. D1几丁质酶活力为0.8 U/mL。Wang等[22]表明在最优产酶条件下进行发酵,其酶活力为0.38 U/mL。本文通过两轮复合诱变获得一株高产几丁质酶的菌株,产酶稳定且酶活力(4.73 U/mL)高,为几丁质酶的生产应用奠定了良好的基础。

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