盐胁迫下2种小麦幼苗抗坏血酸-谷胱甘肽循环的比较

杨颖丽，吕丽荣，李 晶，李翠祥，李 琼

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

土壤盐渍化是世界面临的严重环境问题之一.在世界范围内共有9.54亿hm2的土地发生了盐渍化[1]，中国是位于澳大利亚、前苏联之后的第三大盐碱地分布国家，其次生盐渍化土壤约占耕地面积的1/10[2].甘肃省主要受到盐渍化影响的区域为河西及沿黄灌区，且土壤盐渍化的面积在逐步扩大[3].土壤盐渍化会影响植物生存，造成农业产量减少以及土壤生产能力下降[4].植物在正常生长条件下，活性氧(ROS)的产生和清除保持平衡，因而不会造成机体的损伤.而盐胁迫条件下，植物体内会产生大量的ROS，高浓度的ROS对植物细胞有很强的毒害，危害植物正常的生长生理情况[5].抗坏血酸(AsA)-谷胱甘肽(GSH)循环是植物体内清除ROS的重要途径之一，主要包括4种非酶物质即AsA、脱氢抗坏血酸(DHA)、GSH、氧化型谷胱甘肽(GSSG)和4种酶即抗坏血酸过氧化物酶(APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR).GSH作为DHA 还原的电子受体，经DHAR还原重新生成AsA[6].AsA进而通过氧化酶的反应，将过氧化氢(H2O2)转化成H2O，从而清除ROS来保护细胞免受过氧化伤害.AsA-GSH循环在植物应对逆境条件的过程中起到了重要作用.有文献报道，NaCl胁迫诱导酸枣幼苗根、茎、叶中AsA和DHA含量均呈升高趋势，细胞氧化还原能力(AsA/DHA)先升高后降低，说明酸枣幼苗各器官中可能具备较高的AsA周转和再生能力以抵抗NaCl诱导的氧化胁迫[7].刘志萍等在研究中发现，H2O2含量与DHA和GSSG含量呈显著正相关，表明AsA-GSH循环在减轻NaCl胁迫引起的大麦籽粒过氧化伤害过程中发挥了重要作用[8].相似地，旱柳通过调节AsA-GSH 循环和谷胱甘肽代谢来实现对Cd 的耐性与解毒[9].

陇春27号和陇春30号小麦(TriticumaestivumL.)由甘肃省农科院小麦所选育，为春性小麦，具有适应性广、丰产稳定等特点.不同的是，27号小麦根系发达，根毛多，株型好，穗大整齐，抗旱性强，耐瘠薄，综合性状突出；30号小麦为大穗型品种，灌浆速度快，成熟落黄好，株型紧凑，整齐度好，抗倒性强，群体优.目前关于这2种小麦的研究主要围绕在培育、栽培、丰产性等方面，以及水分胁迫对陇春27号光合参数和渗透调节物质的影响[10].对于这2种小麦在盐胁迫下的AsA-GSH循环的研究鲜见报道.文中以陇春27和陇春30为供试材料，分析不同浓度NaCl(0，25，100和200 mmol·L-1)胁迫下2种小麦幼苗的AsA-GSH循坏中抗氧化物含量和相关酶活性的变化，比较2种小麦在盐胁迫下AsA-GSH循环的差异，为揭示AsA-GSH循环在植物耐盐性的作用机理提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 植物材料的培养

实验材料选取春小麦新品种陇春27和陇春30(购自甘肃省农科院).种子表面消毒15 min(0.1%氯化汞)后，用流水冲洗至无残留氯化汞并使种子吸足水分，黑暗中萌发24 h.种子培养条件为：12 h/12 h(光照/黑暗)、(24±2)℃和300 μmol·m-2·s-1，用含25,100和200 mmol·L-1NaCl 的1/4 Hoagland营养液胁迫处理，对照组用1/4 Hoagland营养液处理.幼苗生长6 d后，测定有关的生理指标.

1.2 AsA,DHA,GSH和GSSG含量的测定

AsA和总抗坏血酸含量的测定参照Kampfenkel等[11]的方法.1.0 g根加入6%的三氯乙酸(TCA)，冰浴研磨，在15 000 r·min-1、4 ℃条件下离心10 min.上清液用于检测AsA和总抗坏血酸含量.AsA含量的检测：取0.2 mL上清液加入0.2 mmol·L-1的磷酸缓冲液PBS(pH 7.4)、10%的TCA、42%的磷酸以及4%的2,2′-联吡啶，最后加入3%的三氯化铁(FeCl3)，混匀于42 ℃水浴40 min，在525 nm处测定吸光值.总抗坏血酸含量测定：取0.2 mL的上清液与0.2 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)和0.2 mmol·L-1PBS(pH 7.4)混匀，随后42 ℃温育15 min，温育结束后加入0.5% N-乙基马来酰亚胺(NEM)，混匀室温放置1 min后，再加入10%的TCA、42%的H3PO4、4%的2,2′-联吡啶以及3%的FeCl3，于42 ℃水浴40 min，在525 nm处测定吸光值，以nmol·g-1鲜重(FW)为单位.DHA的含量为总抗坏血酸和AsA的差值.

GSH和GSSG含量的测定根据Hissn和Hilf[12]的方法.将小麦根在含有5 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)和25% H3PO4的反应液中冰浴研磨，离心30 min(20000 r· min-1)，上清液留待检测.GSH含量的测定：取上清液加入含5 mmol·L-1EDTA的0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)，随后加入0.1 mol·L-1的PBS(pH 8.0，含有5 mmol·L-1EDTA)和0.1%的邻苯二甲醛，室温放置15 min，发射光为420 nm,激发光为350 nm，测定溶液的荧光值.GSSG含量的测定：上清液中加入0.04 mol·L-1NEM后，室温放置30 min，加入0.1 mol·L-1的NaOH，混匀.发射光420 nm,激发光350 nm，测定荧光值.以ng·mg-1FW作为GSH和GSSG含量的单位.

1.3 APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR的酶活测定

根据Nakano和Asada[13]的方法测定APX的活性.称取0.5 g根加入pH=7.0的5.0 mL 50.0 mmol·L-1PBS提取液，内含1 mmol·L-1AsA和1 mmol·L-1EDTA，冰浴研磨，离心20 min(13 000 r· min-1).取适量上清液加入50 mmol·L-1PBS缓冲液(pH 7.0，含有0.5 mmol·L-1AsA)，于25 ℃水浴5 min，加入0.05% H2O2启动反应，以15 s为时间间隔，在290 nm处扫描1 min.APX活性以U·mg-1protein为单位.

AAO的活性参考Shen等[14]的方法测定.称取1.0 g根加入50 mmol·L-1PBS提取液(pH 7.2，内含2 mmol·L-1DTT、 2 mmol·L-1EDTA、2% 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和20%甘油)，冰浴研磨后在10 000 r· min-1、4 ℃的条件下离心30 min.随后吸取0.1 mL的上清液与50 mmol·L-1PBS 溶液(pH 5.6，含5 mmol·L-1EDTA和1 mmol·L-1AsA)混匀.在265 nm处以10 s 为间隔，扫描2 min.单位时间内(1 min)吸光值变化0.1定义为一个酶活单位.

按照Ma和Cheng[15]的方法测定MDHAR和DHAR的活性.1.0 g根加入50 mmol·L-1PBS(pH 7.6，内含2 mmol·L-1DTT、2 mmol·L-1EDTA、2% PVP和20%甘油)，冰浴研磨后在10 000 r· min-1、 4 ℃的条件下离心30 min.MDHAR活性的检测：将0.1 mL的上清液与50 mmol·L-1Hepes-NaOH(pH 7.6，含有0.1 mmol·L-1NADH、0.3 U AAO和0.25 mmol·L-1AsA) 混匀.随后以10 s 为间隔，在340 nm处扫描2 min.单位时间内(1 min)吸光值变化0.01定义为一个酶活单位.DHAR活性的检测：将0.1 mL的上清液与100 mmol·L-1Hepes-NaOH缓冲液(pH 7.0，内含0.6 mmol·L-1DHA和2.5 mmol·L-1GSH)混合均匀.在265 nm处以10 s为时间间隔，扫描2 min.单位时间内(1 min)吸光值变化0.01定义为一个酶活单位.

依照Schaedle和Bassham[16]的方法测定GR活性.将0.5 g根加入到50 mmol·L-1Tris-HCl 提取液(pH 7.5，内含0.1 mmol·L-1EDTA和0.1% PVP)，冰浴研磨，在13 000 r· min-1条件下离心30 min，吸取150 μL的上清液与3 mL的反应液混匀.在340 nm处以30 s为时间间隔，扫描3 min.单位时间(1 min)内吸光值变化0.1定义为一个酶活单位.GR活性以U·mg-1protein为单位.

1.4 数据分析

以上每项实验至少重复3次，实验结果以平均值±标准误差(SE)表示，分别用软件SPSS和Excel对实验数据进行统计分析以及整理制图，不同小写字母表示有显著性差异(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对小麦根AsA和DHA含量的影响

如表1所示，盐胁迫下2种小麦根中AsA和DHA含量均有不同程度的积累.与对照相比，AsA含量在25,100和200 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号小麦根中分别增加约2.89，2.52和3.41倍，在陇春30号根中分别增加约1.63，1.80和2.30倍.相似地，DHA含量在不同浓度NaCl处理的27号根中都有显著增加，而30号根在25 mmol·L-1NaCl处理下DHA含量较对照无显著性差异，100和200 mmol·L-1NaCl处理导致该参数增大较为明显.从表1也可以看出，盐处理下2种小麦根中AsA/DHA比值均增加，且陇春27根的比值随盐浓度增加而增大，而陇春30根的比值随盐浓度增加而减小.

表1 盐处理对小麦根AsA，DHA(nmol·g-1 FW)和 AsA/DHA的影响

注：数据以平均值±标准误差表示,各列中不同小写字母表示在0.05水平有显著差异，下同.

2.2 盐胁迫对小麦根中GSH和GSSG含量的影响

盐胁迫对小麦根GSH和GSSG含量的影响见表2.与对照相比，陇春27号小麦根中GSH含量在25 mmol·L-1NaCl处理下减少约 11%，而在100和200 mmol·L-1NaCl处理下分别增加约19%和77%；对于陇春30号根，GSH含量在100 mmol·L-1NaCl处理下无显著变化，在25 mmol·L-1NaCl处理下降低约20%，在200 mmol·L-1NaCl处理下却明显增加.27号小麦根中GSSG含量随着NaCl浓度的升高均呈显著性增加，在25,100和200 mmol·L-1NaCl处理下分别增加约8%,15%和44%，在25 mmol·L-1NaCl处理的30号小麦根中GSSG的含量较对照减少约25%，其他盐浓度处理下其含量显著增加.此外，200 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号和25 mmol·L-1NaCl处理的陇春30号根中GSH/GSSG比值增加，其他浓度NaCl处理的根中此比值均下降.

表2 盐处理对小麦根GSH，GSSG(ng·g-1 FW)和 GSH/GSSG的影响

2.3 盐胁迫下小麦根APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR活性的变化

与对照相比，陇春27号小麦根APX活性在25 mmol·L-1NaCl处理下减少约23%，100 mmol·L-1NaCl 处理下无明显变化，而200 mmol·L-1NaCl 处理使其增强约36%(表3).同样地，APX活性在25 mmol·L-1NaCl处理的陇春30号根中下降约34%，在100 mmol·L-1NaCl处理下无显著变化，当NaCl处理浓度为200 mmol·L-1时，APX活性升高至对照组的138%.

AAO活性在25和100 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号小麦中较对照分别升高约90%和93%，在200 mmol·L-1NaCl处理下无显著变化.不同的是，陇春30号小麦根AAO活性在25 mmol·L-1NaCl处理组中无显著变化，而在100和200 mmol·L-1NaCl处理组中AAO活性均抑制，其分别下降为对照组的87%和67%(表3).

如表3所示，MDHAR活性在25和200 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号小麦根中较对照组降低，100 mmol·L-1NaCl处理组中无显著变化.陇春30号小麦根MDHAR活性在25和100 mmol·L-1NaCl 胁迫下显著升高，而在200 mmol·L-1NaCl 处理下降低.

与对照组相比，陇春27号小麦根DHAR活性在25 mmol·L-1NaCl处理下无明显变化，随着NaCl浓度的升高而显著增加，分别达到对照组的2.27倍和2.01倍.不同的是，陇春30号小麦根DHAR活性随着NaCl浓度的升高而增高(表3).

从表3可以看出，GR活性在25 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号小麦根中无显著性变化，100和200 mmol·L-1NaCl处理下该酶活性分别增加为对照组的118%和133%.陇春30号小麦根中GR活性在3种浓度NaCl处理下均明显增加为对照的116%(表3).

表3 盐胁迫对小麦根APX，AAO，MDHAR，DHAR和GR活性(U·mg-1 protein)的影响

3 讨论

植物在正常生长情况下，体内ROS的产生和清除之间会保持动态平衡，当植物在遭受高盐逆境胁迫时，动态平衡会被打破，ROS的含量上升，导致植物细胞遭受氧化损伤[17].植物防御能力的强弱与抗氧化系统水平的高低具有相关性，如抗氧化系统的重要组分GSH水平的降低，会导致植物防御能力减弱[6].AsA-GSH循环在植物抵抗逆境胁迫的过程中起着非常重要的作用，可以有效去除ROS和维持细胞内GSH稳态，AsA-GSH循坏由3个相互依赖的氧化还原对组成，包括AsA/DHA，GSH/GSSG以及NADPH/NADP[6].AsA是生物体内重要的抗氧化剂，其作用为清除生物体内H2O2，还原过氧化物，提高植物的抗氧化能力[18].Gallie 等的研究表明，AsA和DHA的含量以及AsA/DHA的比值可以反映细胞内氧化还原的状态，与植物响应逆境胁迫紧密相关[19].有文献表明干旱胁迫条件下冰草可以通过同时上调AsA和GSH合成以及循环代谢，增加AsA、总抗坏血酸、GSH和总谷胱甘肽的含量，从而降低干旱胁迫对植株所造成的氧化胁迫程度，使植株得以生存和生长[20].本研究中盐胁迫诱导下2种小麦根中AsA，DHA以及AsA/DHA比值较对照都有不同程度地增加，由此可推测小麦可能通过增加AsA的含量来消除H2O2，提高AsA-GSH循环的循环率来应对高盐胁迫带来的过氧化损伤.APX以AsA和H2O2为底物，将AsA和H2O2氧化反应成MDHA和H2O，MDHA又被进一步氧化为DHA，而MDHA和DHA分别通过MDHAR和DHAR重新生成AsA，从而消除过量的H2O2.在王聪等的研究中，大豆耐盐品种籽粒中APX，DHAR，AsA含量以及AsA/DHA值的增幅高于同期的盐敏感品种，或降幅低于同期的品种；而DHA含量的增幅低于同期的盐敏感品种[21].本研究中，盐胁迫诱导2种小麦根APX活性均呈现先下降后上升的趋势，而AAO活性则表现出相反的变化趋势.陇春27根中MDHAR活性在100 mmol·L-1NaCl处理下升高，陇春30根中在25和100 mmol·L-1NaCl处理下活性升高，最高浓度(200 mmol·L-1NaCl)处理反而使2种小麦MDHAR活性下降.陇春27号小麦根中DHAR活性在低浓度(25 mmol·L-1)的盐胁迫下无明显变化，随着NaCl浓度的升高，酶活性升高.不同浓度的盐均可诱导陇春30根DHAR活性升高.由上可知，盐胁迫诱导2种小麦根中AsA的积累以及APX活性增加有利于清除H2O2，以减缓过量H2O2造成的氧化伤害.此外，陇春27根中AsA含量的积累可能与DHAR活性升高有关，而陇春30号AsA含量的升高可能是由于AAO活性受到抑制而MDHAR和DHAR活性增强.

GSH是AsA-GSH循环中另一个重要的组成，植物体内GSH的产生受其合成和AsA-GSH循环的调节，并且植物细胞内GSH/GSSG比值和GSH含量是评价AsA-GSH循环运行效率高低的重要因素[22]，GSH通过给DHAR提供电子将DHA还原成AsA，因此GSH在AsA的再生过程中起到非常重要的作用.更为重要的是，GSH是还原型谷胱甘肽，可以清除细胞代谢过程中产生的ROS，减少由于膜脂过氧化作用对细胞造成的伤害[23].本研究中陇春27号根中GSH的含量在25 mmol·L-1NaCl 处理组中下降，而随着NaCl浓度的升高，其含量又显著增加，GSSG含量随着NaCl浓度的升高显著增加.陇春30号GSH和GSSG含量在25 mmol·L-1NaCl处理下均降低，在100和200 mmol·L-1NaCl处理下却有明显的增加，且GSSG含量在最高浓度(200 mmol·L-1)盐处理下达到最大.除了200 mmol·L-1NaCl处理的陇春27号和25 mmol·L-1NaCl处理的陇春30号GSH/GSSG比值增加，其他浓度NaCl处理中二者的GSH/GSSG比值均下降.GSH/GSSG比值的显著下降，说明这2种小麦根都受到了不同程度的氧化损伤.有文献报道，GSSG在GR的作用下被还原形成GSH，促进GSSG向GSH转变[24].本研究中，盐胁迫诱导2种小麦根GR活性都有不同程度的升高，从而有利于GSH的积累.较高的GSH含量可以促进AsA的再生，由此来减缓盐胁迫对植物的氧化损伤[23]，因此增强GR的活性在小麦抗氧化胁迫中发挥着重要的作用.

4 结束语

盐胁迫下2种小麦根可能通过提高AsA和DHA的含量及AsA/DHA的比值提高AsA-GSH循环的循环率，增强了幼苗的抗氧化能力，缓解了NaCl对小麦幼苗造成的氧化损伤.此外，盐诱导的陇春27根中AsA的积累可能与DHAR活性升高有关，而陇春30号AsA含量的增加可能是由于AAO活性的抑制及MDHAR和DHAR活性的增强.

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[1] 刘小京,刘孟雨.盐生植物利用与区域农业可持续发展[M].北京:气象出版社,2002.

[2] 张建锋,张旭东,周金星,等.世界盐碱地资源及其改良利用的基本措施[J].水土保持研究,2005,12(6):28.

[3] 郭世乾,崔增团,傅亲民.甘肃省盐碱地现状及治理思路与建议[J].中国农业资源与区划,2013,34(4):75.

[4] 杨颖丽,张菁,杨帆,等.盐胁迫对两种小麦渗透性调节物及脯氨酸代谢的影响[J].西北师范大学学报(自然科学版),2013,49(1):72.

[5] 张腾国,寇明刚,王圆圆,等.盐胁迫对两种油菜叶片生理指标的影响[J].西北师范大学学报(自然科学版),2014,50(5):85.

[6] 杜琳,张荃.植物谷胱甘肽与抗氧化胁迫[J].山东科学,2008,21(2):27.

[7] 吕新民,杨怡帆,鲁晓燕,等.NaCl胁迫对酸枣幼苗ASA-GSH循环的影响[J].植物生理学报,2016,52(5):736.

[8] 刘志萍,李琲琲,薛海楠,等.NaCl胁迫对大麦籽粒抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响[J].麦类作物学报,2016,36(6):736.

[9] 杨卫东,李廷强,丁哲利,等.旱柳幼苗抗坏血酸-谷胱甘肽循环及谷胱甘肽代谢对镉胁迫的响应[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2014,40(5):551.

[10] 姜小凤,王淑英,李倩,等.水分胁迫对春小麦陇春27号光合参数和渗透调节物质的影响[J].核农学报,2013,27(5):698.

[11] KAMPENKEL K,VANMONTAGU M,INZE D.Extraction and determination of ascorbate and dehydroascorbate from plant tissue[J].AnalyticalBiochemistry,1995,225(1):165.

[12] HISSIN P J,HILF R.A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues[J].AnalyticalBiochemistry,1976,74(1):214.

[13] NAKANO Y,ASADA K.Hydrogen peroxide is scavenged by aserobate specific peroxidase in spinach chloroplasts[J].PlantandCellPhysiology,1981,22(5):867.

[14] SHEN C H,KRISHNAMURTHY R,YEH K W.Decreased L-ascorbate content mediating bolting is mainly regulated by the galacturonate pathway in Oncidium[J].PlantandCellPhysiology,2009,50(5):935.

[15] MA F W,CHENG L L.The sun-exposed peel of apple fruit has higher xanthophyll cycle-dependent thermal dissipation and antioxidants of the ascorbate-glutathione pathway than the shaded peel[J].PlantScience,2003,165(4):819.

[16] SCHAEDLE M,BASSHAM J A.Chloroplast glutathione reductase[J].PlantPhysidogy,1977,59(5):1011.

[17] 王东明,贾媛,崔继哲.盐胁迫对植物的影响及植物盐适应性研究进展[J].中国农学通报,2009,25(4):124.

[18] 吴华.AsA-GSH循环参与海滨木槿盐应答机制的研究[D].济南：山东师范大学,2015.

[19] GALLIE D R.The role of L-ascorbic acid recycling in responding to environmental stress and in promoting plant growth[J].JournalofExperimentalBotany,2013,64(2):433.

[20] 单长卷,韩蕊莲,梁宗锁.黄土高原冰草叶片抗坏血酸和谷胱甘肽合成及循环代谢对干旱胁迫的生理响应[J].植物生态学报,2011,35(6):653.

[21] WANG C,ZHU Y L,YANG L F,et al.Effects of NaCl stress on ascorbate-glutathione cycle in vegetable soybean seeds[J].PlantNutritionandFertilizerScience,2010,16(5):1209.

[22] MA J,ZHENG G,PEI C M,et al.The function of ascorbate-glutathione cycle in salt tolerance of alfalfa mutant[J].PlantPhysiologyJournal,2015,51(10):1749.

[23] MUSGRAVE W B,YI H,KLINE D,et a1.Probing the origins of glutathione biosynthesis through biochemical analysis of glutamate-cysteine ligase and glutathione synthetase from a model photosynthetic prokaryote[J].BiochemicalJournal,2013,450(1):63.

[24] MORADI F,ISMAIL A M.Responses of photosynthesis chlorophyll fluorescence and ROS-scavenging systems to salt stress during seedling and reproductive stages in rice[J].AnnalsofBotany,2007,99(6):1161.