原花青素对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

刘国安,吴亚楠,董 欢,冉苗苗,孟凡雷

(西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州 730070)

帕金森症(Parkinson’s disease， PD)是常见的中枢神经系统退行性疾病，又称震颤性麻痹.流行病学调查显示，PD 已成为中老年人群中除阿尔茨海默病(Alzheimer disease， AD)外最常见的神经系统退行性疾病，临床上主要表现为静止性颤抖、肌强直、运动迟钝和行动不便.近年来抑郁症、失眠和便秘等非运动症状也成为帕金森病患者中常见的临床表现，它们对患者生活的影响甚至超过了运动不便所带来的影响[1]，使患者的生活质量进一步降低.目前认为 PD 的主要病因可能是遗传变异、环境因素、氧化胁迫、线粒体功能障碍、蛋白降解功能障碍等.葡萄籽原花青素(Grape seeds procyanidins， GSP)为葡萄籽中提取的多酚化合物，相关研究证实，该化合物有明显的抗氧化、抗炎等作用[2-3].

PC12 细胞来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，因其胞质内含有大量嗜铬颗粒，并且能够分泌儿茶酚胺，富含合成及分解多巴胺所需各种酶类如儿茶酚胺氧位甲基转移酶、单胺氧化酶和酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase)，还能够产生多巴胺等接近中脑多巴胺能神经元的这些特性，是被用来研究体外神经元损伤及保护机制最常用的细胞系之一[4].鱼藤酮(Rotenone， Rot)是一种广泛使用的杀虫剂和杀鱼剂，能够抑制线粒体复合酶Ⅰ的活性.流行病学调查发现人类长期接触 Rot 与罹患 PD 相关，常被用来建立帕金森症的细胞模型和动物模型、模拟 PD 病理特征，以研究 PD 的病理机制[5-6].

文中建立了 Rot 染毒 PC12 细胞株作为帕金森病细胞模型，以 GSP 作为保护剂，使用细胞形态学和荧光染色及流式细胞术，检测 GSP 对 Rot 诱导的 PC12 毒性及细胞损伤的保护作用，并初步了解其可能的作用机制，从而为 GSP 用于帕金森症的防治提供一定的研究基础.

1 材料与方法

1.1 材料

培养基 DMEM(Gibco公司，美国)，小牛血清(四季青生物技术有限公司，杭州)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)、MTT(索莱宝科技有限公司，北京)、台盼蓝(Sigma公司，美国)、吉姆萨染色剂(Sigma公司，美国)、碘化丙啶(PI，Sigma公司，美国)、Hoechst 33342(Sigma公司，美国)、ROS 检测试剂盒(贝博生物公司，北京)，Rhodamine 123(碧云天生物技术研究所，江苏)，Annexin V-FITC(eBioscience，美国)，二甲基亚砜(DMSO Merck，美国)，葡萄籽原花青素(慧科生物公司，西安)，其他试剂为国产分析纯.大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 PC12 细胞系引自兰州军区总医院.

超净工作台(苏净集团，江苏)，CO2饱和湿度培养箱(Forma Scientific，美国)，倒置显微镜(Olympus CKX41SF，日本)，细胞培养板(Costar，美国)，流式细胞仪(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美国)，荧光显微镜(Leica DMI4000B，德国)，高速冷冻离心机(Beckman Coulter Allegra64R，美国)，微量高速离心机(TG16-W，长沙湘仪离心机仪器有限公司)，低温冷冻离心机(TDL-5000B，飞鸽牌)，酶标仪(BIO-RAD m680，美国).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 PC12 培养于 DMEM 培养基中[7]，内含 10%小牛血清及青霉素(100 U·mL-1)与链霉素(100 μg·mL-1)，在 37℃，5% CO2饱和湿度恒温箱中培养，取对数生长期细胞用于实验.

1.2.2 台盼蓝染色法检测鱼藤酮的细胞毒性 将浓度为5×104·mL-1的 PC12 细胞悬液以每孔300 μL 接种于 24 孔培养板，后置于 37 ℃， 5% CO2饱和湿度培养箱中培养；24 h 之后，加入 Rot 终浓度为 0.1,0.2,0.5,1.0 μmol·L-1的完全培养基300 μL，空白组仅加入不含 Rot 的完全培养基；加药后每隔 24 h，取 0.4% 的台盼蓝染液加入到细胞悬液中染色 3～5 min 后，用血球计数板统计活细胞数量，绘制细胞生长曲线.

1.2.3 MTT 法测定鱼藤酮对细胞的毒性和原花青素的保护作用 PC12 细胞以5×104·mL-1接种 100 μL 于 96 孔培养板，预培养 24 h 后，相应孔中分别加入含不同浓度Rot 的完全培养基继续培养24,48 和 72 h.保护组加入 GSP 后 2 h 再加入 Rot.处理完后，吸弃上清，加入MTT(5 mg·mL-1)溶液 20 μL 孵育 4 h；弃上清后每孔加入 DMSO 溶液 150 μL，用微孔板振荡仪振荡10 min；待紫色结晶物溶解后用酶标仪在 490 nm 处检测相应吸光值.计算细胞生长率，生长率/%=(A处理组/A对照组)×100%.

1.2.4 倒置显微镜及吉姆萨染色观察细胞形态变化 细胞以10×104·mL-1，接种于六孔细胞培养板预培养 24 h；分别加入浓度为1 μmol·L-1Rot,10 μg·mL-1GSP+1 μmol·L-1Rot 的完全培养基，对照组用完全培养基代替，保护组预先加入 GSP 孵育 2 h，继续培养 24 h 后光学倒置显微镜下观察并拍照.吉姆萨染色时，PBS(pH=7.0)洗2次之后用甲醇∶冰乙酸=3∶1 固定 20 min，再用稀释的吉姆萨染液染色 30 min，PBS 冲洗 3 次，明场下观察并拍照.

1.2.5 Hoechst33342 染色观察细胞核形态的变化将细胞配成浓度为 10×104·mL-1悬液，于六孔板接种爬片预培养 24 h；处理同上，后用 PBS 洗 3 次后以 4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次；以10 μg· mL-1Hoechst 33342 染液室温染色10 min，PBS再洗 3 次；荧光显微镜下观察细胞核形态并拍照.

1.2.6 DCFH-DA 单染法检测胞内ROS含量 接种10×104·mL-1的PC12 细胞悬液于六孔板预培养 24 h 后，处理同前.分别培养3,6,12 h后，800 r·min-1离心 5 min 收集细胞，PBS 洗 2 遍，加入1 mL，10 μmol·L-1DCFH-DA 荧光探针，37 ℃ 温箱中孵育 30 min，离心收集细胞后 PBS 洗 2次以除去未进入细胞的 DCFH-DA，与 PBS 缓冲液 300 μL 混匀后经 260 目尼龙网过滤，上流式细胞仪检测.

1.2.7 荧光染色及流式细胞术检测胞内线粒体膜电位变化 细胞6孔板接种爬片，浓度及处理同 ROS 含量测定，预培养 24 h；原花青素保护 2 h 后加入 Rot 继续培养 24 h，之后用 PBS 洗 2次；加入 DMEM 培养基配制的10 mmol·L-1Rhodamine 123 染液，37 ℃ 孵育 30 min； PBS 洗 2次，荧光显微镜下观察线粒体膜电位的变化并拍照记录.流式检测时，细胞接种于 6 孔板，浓度及处理同上述荧光染色，后以转速1 000 r·min-1离心收集细胞，PBS 洗 2次；加入10 mmol·L-1Rhodamine 123 染色，37 ℃ 孵育 30 min； PBS 洗 2次以除去未进入到细胞当中的荧光探针；再补充 PBS 缓冲液至 300 μL，混匀后经 260 目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测.

1.2.8 AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 将浓度为10×104·mL-1的 PC12 细胞悬液接种于六孔板预培养 24 h；GSP 预培养 2 h 后，加入 Rot 继续培养 24 h；分别收集细胞，调整每个样品细胞密度为1×106·mL-1， PBS 洗涤 1 次，以 190 μL 结合缓冲液悬浮细胞，吹均匀后加入 5 μL Annexin V-FITC，混匀，4 ℃ 条件下避光作用20 min；再加 5 μL PI，混匀后 4 ℃ 条件下避光作用 10 min；再补充结合液 300 μL，并在 1 h 内上流式细胞仪检测.

1.2.9 数据统计 所有实验均重复至少 3 次，结果以 Mean±SD 表示，数据进行t检验和方差分析，P≤0.05 为差异显著，P≤0.01为差异极显著.

2 结果

2.1 鱼藤酮对 PC12 细胞的毒性

Rot 处理 PC12 细胞不同时间后，台盼蓝排染法检测结果显示，不同浓度 Rot 对细胞的生长抑制效应不同.随着处理时间和处理浓度的增加，表现为对细胞生长抑制增强.如图 1 所示，低浓度作用下(0.1,0.2 μmol·L-1)，细胞生长速率就已经开始减慢，表现为生长抑制，随药物浓度的增高其生长抑制作用增强， 并且具有时间-浓度依赖性，当药物浓度增加至 0.5 及1 μmol·L-1时，细胞生长几乎全部被抑制.

图1 台盼蓝排染法检测鱼藤酮对 PC12 细胞 生长的抑制作用

MTT 法检测显示同样结果，如图 2 所示，浓度为0.1～2 μmol·L-1的 Rot 能够使细胞生长率降低，而且细胞生长率与药物处理浓度呈负相关，具有剂量-时间效应.Rot 浓度为0.2,0.5和1 μmol·L-1处理 24 h 后，细胞生长率分别为92.3%,80.7%和73.2%；1 μmol·L-1Rot 在处理 24,48和72 h之后，细胞存活率分别为73.2%,66.5%和 53.0%，说明细胞生长率与药物处理浓度的时间依赖效应更明显，根据 24 h 作用结果，选用1 μmol·L-1Rot 处理作为细胞损伤模型的浓度.

图2 MTT 染色法检测鱼藤酮对 PC12 细胞 生长的抑制作用

2.2 MTT 法测定鱼藤酮对细胞的毒性和原花青素的保护作用

用不同浓度 GSP 单独作用细胞 24 h 发现，1 μg·mL-1时对细胞有微弱的生长促进作用，5,10,15 μg·mL-1时促进作用进一步增强.当浓度再高时(25,50 μg·mL-1)，表现为抑制作用(图3).

图3 原花青素对 PC12 细胞生长的影响

用不同浓度 GSP 预保护再加入 Rot 时(图4)，在1～15 μg·mL-1的 GSP 均显示保护作用.与 Rot 单独处理相比，细胞生长率从 75.9% 分别上升到86.7%,110.4%,122.7%和 102.5%，说明在此浓度范围内，GSP 可以抑制 Rot 引起的细胞生长率的降低.当 GSP浓度为10 μg·mL-1时作用最强.因此后续实验选用 10 μg·mL-1作为 GSP 的保护浓度.

*P≤0.05，与空白对照组相比；#P≤0.05，与1 μmol·L-1Rot处理组相比

图4 原花青素对鱼藤酮毒性的抑制作用

Fig 4 The inhibition of GSP to Rot cytotoxicity

2.3 原花青素对 PC12 细胞形态学保护作用

检测原花青素对 Rot 处理的 PC12 细胞保护作用时，倒置显微镜观察发现(图5A)，对照组和 GSP 单独处理组的细胞贴壁生长，胞体呈梭形，突起较长，细胞充分铺展，折光性强(图5A a).而1 μmol·L-1Rot处理下细胞明显突起回缩，胞体缩小，细胞间隙增大，部分细胞丧失贴壁性而悬浮于培养液中(图5A b)；10 μg·mL-1GSP 保护组中，漂浮细胞数量减少且胞体变大，不规则梭形或多边形细胞贴壁,细胞开始增多(图5A c).

吉姆萨染色法能够更清晰地观察细胞内部结构.从图 5B a可以看出,对照组细胞的生长状态良好，结构清晰，核大且染色质染色均匀.Rot 处理细胞(图5B b)皱缩变圆，细胞核染色质凝集，染色加深，部分细胞核碎裂，呈现一定凋亡特征；而加入 GSP组，细胞开始呈不规则多边形，染色均一，对 Rot 诱导的凋亡特征有所缓解(图5B c).这些结果说明,GSP 对 Rot 诱导的细胞形态的改变有一定程度的抑制和保护作用.

Hoechst 33342 作为 DNA 荧光染料，可渗透细胞膜进入细胞内使 DNA 着色.当细胞发生凋亡时，细胞的膜通透性增强，对 Hoechst 33342 摄取量增加.再者凋亡细胞染色质高度浓聚，最终使得染色后的细胞荧光强度增强[8].图 5 C 为荧光染料 Hoechst 33342 染色的结果，可以看到，对照组细胞(图5C a)核呈卵圆形，大小均一，荧光均匀；而 Rot 处理后(图5C b)，细胞荧光增强,说明出现了染色质的凝集，表现为细胞内荧光强度分布不均一，且细胞核有裂解现象.保护组细胞核形态有所恢复，轮廓清晰，染色质分布较均匀，镜下凋亡细胞比例减少(图5C c).

综上可以看出，形态学观察表明，Rot 可引起细胞核碎裂，染色质凝集、浓缩，表现出细胞凋亡的典型特征，而 GSP 可起到保护作用.

A.倒置显微镜观察细胞形态； B.吉姆萨染色法观察细胞形态；C.Hoechst 33342染色观察对细胞核影响;

a.空白对照；b.1 μmol·L-1鱼藤酮；c.1 μmol·L-1鱼藤酮+10 μg·mL-1原花青素

图5 原花青素对Rot处理PC12细胞形态的保护作用(×400)

Fig 5 GSP improved changes in cell morphology damaged by Rot(×400)

2.4 原花青素对鱼藤酮引起胞内 ROS含量变化的影响

Rot 作为线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的抑制剂，可以引起细胞内 ROS 水平的升高，而 GSP 为活性较强的天然抗氧化剂，本实验通过流式细胞术检测其是否具有降低细胞内的 ROS 水平的能力.实验用 ROS 检测试剂盒 DCFH-DA 染色后流式细胞仪检测.荧光染料 DCFH-DA 能自由扩散通过细胞膜，被细胞质内酯酶水解成 DCFH，DCFH 无法再出入细胞，在胞内 ROS 存在时氧化成 DCF 并发绿色荧光，其荧光强度与细胞内 ROS 的含量呈正相关[9].

流式细胞仪检测结果如图 6 显示，在 Rot 作用 3,6 h 后，胞内 ROS 水平分别升高为对照组的 304.1%和 175.8%；加入 GSP 保护时，ROS 明显下降，分别为对照组的 154.2%和 156.2%，尤其是 3 h 的作用，ROS 的降低十分明显.而 12 h 处理时，无论 Rot 处理还是 GSP 保护，均无明显差异，说明 Rot 引起的 ROS 升高在 12 h 回落.该结果表明,GSP 能够降低由 Rot 引起的 ROS 水平升高，这在一定程度上反映了 GSP 可以使细胞免受或减少氧化胁迫的损伤.

CK.空白对照；R.1 μmol·L-1鱼藤酮；R+G.1 μmol·L-1鱼藤酮 +10 μg·mL-1原花青素

图6 原花青素对鱼藤酮引起的细胞内ROS升高的 抑制作用

Fig 6 Inhibitory effect of GSP on Rot induced intracellular ROS elevation

2.5 原花青素对鱼藤酮引起的胞内 MMP变化的影响

有实验证明，在细胞受到凋亡因素作用后，最早能记录到的变化是线粒体膜电位(Mitochondria membrane potential， MMP)的降低，一旦出现 MMP 水平下降，细胞即进入不可逆转的凋亡过程[10].Rhodamine 123 是一种可特异性染色活细胞线粒体的细胞染料，可透过细胞膜进入活细胞的线粒体，在线粒体基质内聚集，并发出黄绿色荧光.因为线粒体对 Rhodamine 123 的摄取能力取决于跨膜电位的高低，因此可根据荧光强度间接反映 MMP 水平的高低，也可反映线粒体膜受损程度，也即细胞受损程度.

从荧光显微结果(图 7)可以看出，对照组细胞质中绿色荧光均匀而强烈，Rot 处理 24 h 后使荧光强度下降，说明胞内 MMP 水平降低；而当加入 GSP 后，荧光强度回升，表明MMP升高；流式细胞术检测进一步表明(图 8)，Rot 处理 24 h，细胞内荧光比率下降为对照的62.3%，加入 GSP 后，荧光比率上升到 81.9%.说明 Rot 损伤线粒体，导致 MMP 下降，而用 GSP 预保护 2 h 能够有效缓解 Rot 引起的 MMP 的降低，具有稳定 MMP 水平的作用.

a.空白对照；b.1 μmol·L-1 鱼藤酮；c.1 μmol·L-1 鱼藤酮 +10 μg·mL-1 原花青素

CK.空白对照；R.1 μmol·L-1鱼藤酮；R+G.1 μmol·L-1鱼藤酮 +10 μg·mL-1原花青素.*P≤0.05，与空白对照组相比

图8 流式细胞仪检测原花青素对鱼藤酮引起 PC12 细胞线粒体膜电位变化的影响

Fig 8 Effect of GSP on the changes of mitochondrial membrane potential of PC12 cells induced by Rot with flow cytometry

2.6 原花青素对鱼藤酮诱导细胞凋亡的影响

为进一步明确 Rot 对细胞凋亡的影响及 GSP 的保护作用，采用 Annexin V/PI 双染法并以流式细胞术进行分析.如图 9 结果显示，对照组细胞中分布于Annexin V-/PI-区的正常细胞比例为89.2%，这部分细胞未发生 PS 外翻,细胞膜完整[11]，自然凋亡细胞比例占 8.2%；Rot 处理之后总凋亡细胞比例上升至 18.5%，分布在 Annexin V+/PI-区的早期凋亡细胞和 Annexin V+/PI+ 区的晚期凋亡细胞比例各占到 11.2% 和 7.3%；GSP 保护组中，凋亡细胞数量下降到 13.2%(早期凋亡 8.8%+晚期凋亡 4.5%).由此结果可知，Rot 作用于细胞 24 h 之后，导致正常细胞数减少，凋亡细胞增多，而加入 GSP 保护之后，在一定程度抑制了 Rot 诱导的凋亡，使得细胞凋亡率降低.

CK.空白对照；R.1 μmol·L-1鱼藤酮；R+G.1 μmol·L-1鱼藤酮 +10 μg·mL-1原花青素

图9 原花青素降低了鱼藤酮诱导的细胞凋亡

Fig 9 GSP reduced Rot induced apoptosis

3 讨论

帕金森病是一种老年人中常见的中枢神经系统变性病，患者中 80% 为 65 岁及以上人群[12]，位居神经退行性疾病第二，总体影响到 1% 以上的老年人，且发病率随年龄的增长而成倍升高.随着老龄化社会的到来，老龄人口的增加导致全球帕金森病患病率呈明显上升态势.中国拥有最多的老年人口，最近的一项研究估计，中国有 200 万 PD 患者，占世界人口最多的 15 个国家的 PD 患者的 48%.预计到 2030 年这个数字将增加到 500 万[13].因此，PD 的病因探索和防治研究非常急迫.

PD 的发病机制并未完全明晰，可能为遗传、环境、免疫紊乱等多因素相互作用所致，研究显示主要与黑质-纹状体多巴胺(Dopamine， DA)神经通路变性以及 Lewy 小体的形成有关.有研究表明线粒体功能异常、氧化胁迫引起 DA 代谢紊乱，引起自由基清除系统障碍、内质网应激反应，导致 DA 神经元死亡[1].更有研究结果显示，PD 患者大脑黑质纹状体神经元中出现大量的脂质过氧化、DNA 氧化损伤的产物以及蛋白质的氧化产物[14].因此减少氧化胁迫的抗氧化剂可能对 PD 有预防或者缓解作用.传统中药在帕金森病治疗中积累了丰富的经验，研究发现中药方剂或其有效成分可以通过抗氧化胁迫[15]等发挥改善帕金森病模型的作用，说明氧化胁迫与 PD 发病密切相关，使得抗氧化剂用于防治PD呈现良好前景[16].Rot 作为高亲脂性化合物，可顺利透过血脑屏障进入中枢神经系统，在细胞中作为线粒体电子传递链复合体Ⅰ的抑制剂，使得细胞对氧的利用发生障碍，致细胞能量产生不足，同时细胞自身自由基的清除能力下降而导致氧自由基大量聚集[17].GSP 是从葡萄籽中提取出的多酚物质，属于生物类黄酮，分子结构中含有多个酚羟基[18]，使得 GSP 具有很强的清除自由基能力.流行病学调查发现食用富含 GSP 的浆果(如蓝莓和草莓)可以降低PD的患病风险[19].在阿尔茨海默病研究中，GSP 可提高 ATP 酶、超氧化物歧化酶的活性和 Bcl-2 的表达，还抑制了 Bax 蛋白的表达，从而改善阿尔茨海默病大鼠的认知功能[20].文中通过对 PC12 细胞的生长和存活率检测表明，Rot对 PC12 的毒性具有剂量和时间依赖性.当用 GSP 保护细胞时，24 h 后在1～15 μg·mL-1的范围内GSP均显示保护作用，其作用随浓度增加而增高.Rot 对细胞的毒性在形态学上也有明显表现，在显微镜下观察细胞可以看出，其毒性使得原本平铺多角形细胞皱缩，突起回缩，胞体缩小；吉姆萨染色观察细胞内部结构进一步明确 Rot 处理细胞核染色质凝集，染色加深，部分细胞核碎裂，呈现一定凋亡特征；而 GSP 预保护显示 GSP 对 Rot 诱导的细胞形态的改变有明显的抑制和保护作用(图5).DNA 荧光染料 Hoechst 33342 对细胞核的进一步检测表明，GSP 的保护作用使 Rot 处理后细胞凝集的染色质分布变得较为均匀，轮廓清晰(图5C).Rot 作为线粒体呼吸链电子传递抑制剂，使得电子受体氧分子转变为 ROS，检测表明，作用 3 h 后，细胞 ROS 明显升高，而 GSP 使其极大降低，几乎只有原来的一半；6 h 的 ROS 活性虽然显著降低，GSP 也还是显示了一定的抑制作用，GSP 也能够有效缓解 Rot 引起的 MMP 的降低，并减少了细胞凋亡.

本研究中多个指标显示，GSP 这种具有抗氧化活性的多酚类色素，在 Rot 诱导的 PC12 细胞凋亡模型中可能通过降低细胞 ROS 生成、恢复线粒体膜电位水平，使由 Rot 引起的细胞损伤、生长抑制等得到明显改善，抑制 Rot 引起的细胞凋亡，具有防治帕金森病的潜质.

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