孙振仪,曹 芳,逄晓薇,丁 浩,陈红岩,高 夏,刘晓娜,武 宁,吴媛媛
(中粮长城葡萄酒(烟台)有限公司,山东蓬莱265600)
随着人们生活水平的日益提高,人们对食品安全越来越重视。目前国内葡萄酒市场的消费量也越来越大,葡萄酒中的添加剂也受到人们的重视。其中山梨酸、苯甲酸为防腐剂,在GB 15037《葡萄酒》中均有限量要求,而糖精钠、安赛蜜为人工合成甜味剂,在食品工业中日益广泛应用,但在葡萄酒中不允许添加,然而在实际生产中不法商贩超标准使用的现象时有发生,因此有必要加强对其监管和检测。使用液相色谱法,如果色谱实验条件不合适,会导致葡萄酒一些物质出峰时间与要检测的4种物质出峰时间相同,从而对检测结果产生较大的影响,导致实验数据不准确。
GB 5009.28—2016为食品中山梨酸、苯甲酸和糖精钠的测定通用方法,对于葡萄酒大批量样品检测时,前处理过程较复杂、耗时较长,本实验针对葡萄酒中安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸的检测方法进行实验条件优化,通过实验减少了前处理的过程,节省时间及成本,对于葡萄酒生产、检测等需对大批量葡萄酒样品进行检测的机构,具有重要的意义。
酒样:市售葡萄酒样品,葡萄酒经0.45 μm微孔滤膜过滤。
试剂:乙酸铵(色谱纯),天津市光复精细化工研究所;甲醇(色谱纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;氨水(色谱纯),天津市大茂化学试剂厂;乙酸(色谱纯),天津市大茂化学试剂厂。
试剂配制:乙酸铵(20 mmol/L)溶液:称取1.54 g乙酸铵,加入适量水中溶解,用水定容至1000 mL,用氨水或乙酸调整至合适的pH值,经0.45 μm水相微孔滤膜过滤后备用。
标准溶液:安赛蜜,安赛蜜溶液标准物质BW3510,1.00 mg/mL;糖精钠(CA16901010,纯度99.0%),精确称取0.100 g糖精钠标准物质,溶解转移至100 mL容量瓶中定容,浓度为1.00 mg/mL;苯甲酸,苯甲酸溶液标准物质GBW(E)100006,1.00 mg/mL;山梨酸,山梨酸溶液标准物质GBW(E)100007,1.00 mg/mL。
安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸混合标准工作溶液:分别准确吸取安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸标准溶液0 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL至10 mL容量瓶中,加水定容,摇匀。配制成质量浓度分别为0 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的混合标准系列工作溶液,临用现配,经0.45 μm微孔滤膜过滤。
仪器设备:Agilent1200型高效液相色谱仪(配自动进样器、二极管阵列检测器),Agilent公司;分析天平(感量0.0001 g),METTLER TOLEDO公司。
色谱柱:ZORBAX SB-C18柱:4.6×250 mm,粒径5 μm;流动相:甲醇∶乙酸铵溶液=8∶92;流速:1 mL/min;检测波长:230 nm;进样量:10 μL;柱温:30℃。
国标法GB 5009.28—2016适用于食品中糖精钠、苯甲酸和山梨酸3种物质的测定,通过加水提取,脱脂或经蛋白沉淀剂沉淀蛋白,采用液相色谱分离、检测。而葡萄酒的酒精度较低,在生产过程中要经过下胶、下皂土等澄清步骤,成品酒中已除去了酒中不稳定的蛋白质类物质。
实际检测过程中发现,葡萄酒可以直接进行液相色谱分离。而且增加安赛蜜标准物质后,安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸在现有条件下可以得到很好的分离度,因而采取对葡萄酒样品不进行前处理,直接检测4种物质的方式。
国标法GB 5009.28—2016进行色谱分离时,使用的流动相为甲醇∶乙酸铵溶液=5∶95。但由于葡萄酒样品内容物质众多,背景干扰较大,最终选用流动相为甲醇∶乙酸铵溶液=8∶92。通过调整乙酸铵溶液的pH值,就可以很好地对待测4种物质进行分离(如图1、图2、图3、图4)。
图1 乙酸铵溶液pH4.81时4种物质的混标色谱图
图2 乙酸铵溶液pH5时4种物质的混标色谱图
但在实际葡萄酒样品检测中,不同pH值的流动相对安赛蜜和糖精钠的保留时间、峰高和峰宽的影响较小,但对山梨酸和苯甲酸的保留时间、峰高和峰宽的影响较大(如图5、表1)。
根据实际色谱分离效果,选择乙酸铵溶液pH5.20作为在葡萄酒样品中检测安赛蜜、糖精钠、苯甲酸和山梨酸的流动相条件,可以实现4种待测物质与葡萄酒中其他化合物的分离,杂质干扰少(如图6、图7、图8、图9)。
图3 乙酸铵溶液pH5.2时4种物质的混标色谱图
图4 乙酸铵溶液pH5.4时4种物质的混标色谱图
图5 在不同pH值流动相下4种物质的保留时间
表1 不同pH值流动相4种物质的峰宽 (min)
图6 乙酸铵溶液pH5.2时,红葡萄酒空白样品色谱图
图7 乙酸铵溶液pH5.2时,红葡萄酒加标样品色谱图
图8 乙酸铵溶液pH5.2时,白葡萄酒空白样品色谱图
图9 乙酸铵溶液pH5.2时,白葡萄酒加标样品色谱图
分别配制各组分浓度相等混合标准序列(20mg/L、50 mg/L、100 mg/L),进样10 μL,以峰面积和浓度进行线性回归,回归方程和相关系数见图10、图11、图12、图13。
图10 安赛蜜标准曲线
以红葡萄酒为例,分别吸取一定量(3个水平)的安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸标准溶液,加酒定容,配制成混合标准系列工作溶液,经液相色谱分离、检测,结果见表2。
由表2可知,加标回收率在101.2%~106.8%之间,相对标准偏差为0.41%~3.17%(n=5)。
图11 糖精钠标准曲线
图12 苯甲酸标准曲线
本研究在GB 5009.28—2016液相色谱法的基础上改进检测葡萄酒中安赛蜜、山梨酸、苯甲酸和糖精钠的方法,使葡萄酒样品可以直接进样,同时检测以上4种物质。在流动相pH5.20时,即可较好分离被测物质和葡萄酒中其他物质,降低对检测结果的干扰,得到了较为满意的结果。
[1]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定:GB 5009.28—2016[S].北京:中国标准出版社,2017.
[2]白静.高效液相色谱法测定食品中的安赛蜜[J].食品科学,2011,32(16):245-248.
[3]河北省卫生和计划生育委员会.食品安全地方标准食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾(安赛蜜)的测定高效液相色谱法:DBS 13/006—2016[S].2016.
[4]中华人民共和国卫生部.饮料中乙酰磺胺酸钾的测定:GB/T 5009.140—2003[S].北京:中国标准出版社,2004.