液相色谱-串联质谱测定鸡肉中喹乙醇残留标示物3-甲基喹恶啉-2-羧酸

李二粉, 张媚玉, 马合勤, 张嘉慧, 刘 戎, 曾振灵, 贺利民*

(1. 国家兽药残留基准实验室(华南农业大学), 华南农业大学兽医学院, 广东 广州 510642; 2. 佛山市顺德区农业综合服务中心, 广东 佛山 528333)

喹乙醇属于人工合成的喹恶啉类药物,是20世纪70年代初由德国拜尔公司研究合成的抗菌促生长剂,抗菌谱广。喹乙醇具有蛋白同化作用,能提高饲料转化率[1]。但鉴于该药物的安全性问题,欧盟和美国等相关国家已禁止喹乙醇在食品动物生产中使用[2],我国规定喹乙醇禁用于家禽和水产动物[3], 2019年5月1日起禁用于食品动物[4]。然而,受经济利益的驱使,喹乙醇在养殖业中存在非法使用现象。近期,在山东等地的饲料生产企业、养殖场发现非法添加、滥用喹乙醇药物现象,对动物性食品安全构成严重威胁。公众对食品安全关注度的提升以及国际贸易对食品安全管理的严格性,给喹乙醇的残留分析技术提出了更高的要求。

喹乙醇在动物体内代谢很快,3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)是其主要代谢物,国际食品法典委员会(CAC)认定MQCA为喹乙醇的残留标示物[5]。MQCA在动物组织中主要以与蛋白质结合的状态存在[6],通常的提取液不能将其从动物组织中提取出来,直接采用有机溶剂和酸化提取液提出、再经液-液反萃取或固相萃取净化的文献有许多[7-12],但这些方法只能够提取游离形式的少量MQCA。采用酶解[13-16]、酸解[17-19]和碱解[20,21]的水解方式较多,原理都是破坏MQCA与组织的共价结合,使其游离出来,再提取、净化。但上述基于3种水解方式的文献报道均是采用传统的空白试样添加评价回收率的方式来构建分析方法,无法反映水解方式对喹乙醇给药制备的阳性鸡肉样品的实际解离效率,导致基于不同水解方法测定MQCA残留的结果产生大的偏差。更令人遗憾的是,这些文献中报道的采用3种方式水解试样后,绝大多数采用盐酸将水解液pH调至强酸性条件,然后采用MAX混合型阴离子交换固相萃取小柱净化。此时,MQCA的羧基(-COOH)不能够离解,不是以负离子形式存在;相反,MQCA在强酸条件下应该主要为喹恶啉正离子形式,因而其无法与MAX上的季铵正离子发生离子相互作用,结果MQCA的回收率都非常低。

为此,本研究采用给鸡灌服喹乙醇,以制备的阳性鸡肉试样为对象,系统分析比较了基于酶解、酸解和碱解3种方式水解测定MQCA残留量的结果。采用优化后的最佳碱水解方法水解鸡肉试样,水解液直接采用MAX混合型阴离子交换固相萃取小柱净化、富集,建立了简便、灵敏、科学和可靠的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定鸡肉组织中MQCA残留的分析方法,在动物性食品中MQCA残留的日常监督检测中获得广泛的应用。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

LC-30A超高效液相色谱分析系统(日本岛津公司); API 5500三重四极杆质谱仪(美国ABI公司); Thermo D-37520型高速冷冻离心机(美国Thermo Scientific公司); SHA-B型恒温水浴振荡器(常州国华电器有限公司); Milli-Q Advantage A10超纯水系统(美国Millipore公司); CNW Poly-Sery MAX混合型阴离子交换固相萃取小柱(3 mL/60 mg, 60 μm,上海安谱公司)。

氢氧化钠(上海强顺化学试剂有限公司);甲醇和乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);甲酸(色谱纯,德国Sigma-Aldrich公司);正己烷(分析纯,广州化学试剂厂); MQCA标准品(纯度≥ 99%,中国兽医药品监察所); MQCA-d4(纯度≥ 99%,加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

健康鸡购于广东智威农业科技股份有限公司。

1.2 阳性鸡肉样品的制备

将从市场购得的6只健康鸡((1.5±0.1) kg)适应性饲养一周,在确定无MQCA残留的情况下,随机分为空白组和给药组。空白组3只正常饲养,给药组3只以40 mg/kg b. w.的剂量,每天给药1次,连续给药3天,分别于末次给药后12 、24和48 h宰杀,给药组3只鸡分别命名为1号鸡、2号鸡和3号鸡,同时相应时间点宰杀空白鸡作为对照品,分取鸡肉置-20 ℃冷藏,待检测。

1.3 前处理方法

准确称取2 g(±0.01 g)捣碎的鸡肉,置于50 mL聚丙烯离心管中,加入6 mL 1 mol/L NaOH溶液,涡旋1 min后置于50 ℃恒温水浴锅中,振荡水解1 h。取出冷却,于4 ℃ 9 000 r/min离心10 min,取上清液,加入6 mL正己烷除脂,9 000 r/min离心5 min,吸取下层溶液,定容至8 mL,取4 mL过MAX小柱(预先用3 mL甲醇和3 mL 0.2% (v/v)氨水活化),依次用3 mL水洗,3 mL 2%(v/v)甲酸甲醇洗脱,洗脱液用氮气吹干。用20%(v/v)甲醇水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)溶解残渣,涡旋1 min,超声10 min后,于4 ℃ 15 000 r/min离心10 min,上机检测。

1.4 液相色谱和质谱条件

液相色谱条件:反相色谱柱Phenomenex Luna C18(150 mm×2 mm, 5 μm),柱温35 ℃,流速为0.25 mL/min,流动相A为0.1%(v/v)甲酸乙腈,流动相B为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0.5 min, 5%A; 0.5～4.0 min, 5%A～70%A; 4.0～7.0 min, 70%A～90%A; 7.0～9.0 min, 90%A～5%A。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI),选择反应监测(SRM)正离子模式,电喷雾电压(IS)为4 500 V,雾化气压力34 kPa,气帘气压力(CUR)为40 kPa,离子源温度(TEM)为600 ℃, MQCA及其内标物质谱参数见表1。

* MQCA: 3-methyl quinoline-2-carboxylic acid; quantitative ion.

1.5 标准溶液的配制

用甲醇配制20、 100和1000 μg/L的MQCA标准工作液和100 μg/L MQCA-d4 内标溶液。

基质匹配标准工作液：空白鸡肉试样按1.3节处理,获得空白基质提取液,用于稀释MQCA标准溶液,制备1、2、5、10、50、100 μg/L系列基质匹配标准工作液(内标法均加入100 μg/L MQCA-d4内标溶液100 μL)。

2 结果与讨论

2.1 实验条件考察

2.1.13种方法水解效率的比较

分别采用酶解[14]、酸解[19]和碱解(文献[21]方法及本文方法) 4种方式水解1号鸡,2号鸡和3号鸡鸡肉样品(每个样品6个平行),采用内标法定量,LC-MS/MS测定结果见表2。酶解和酸解方法仅检测到1号和2号鸡肉组织中低含量的MQCA残留,而且相对标准偏差(RSD)较大,3号鸡均未检出MQCA;本工作建立的碱解法则在1、 2和3号鸡中都检出了MQCA残留,含量分别为282.0、170.4和5.9 μg/kg, 1号鸡和2号鸡中测得的MQCA含量分别高出酶解法和酸解法近30和20倍。这表明,由于MQCA与组织大量共价结合,采用文献的酶解和酸解方法可能没有全部将MQCA从组织中解离出来。为了证明这点,酶解和酸解溶液不进一步采用固相萃取净化,将酸解液和酶解液用流动相稀释后直接上机检测,表明两种方法的确均不能够将MQCA从组织中有效解离出来。与碱解法相比,1号鸡和2号鸡的酸解效率小于15%,酶解法则小于40%。而且两种方法都不适合在酸性条件下用MAX阴离子交换小柱净化、富集正离子形式的MQCA。因此,水解不彻底和过柱条件不合理最终导致两种方法的测定结果都非常低(1号鸡和2号鸡)或低浓度不能够检出(3号鸡);而碱解法可将鸡肉组织彻底分解为溶液,以共价结合存在的MQCA有效释放出来,碱性水解液直接过MAX小柱净化,合乎阴离子交换作用原理,策略科学合理。

2.1.2氢氧化钠水解条件的优化

为了获得最佳的水解效果,在温和的50 ℃水解温度条件下,对氢氧化钠溶液浓度和水解时间进行了进一步考察优化。实验选择了0.5、1.0、1.5和2.0 mol/L的NaOH溶液水解鸡肉试样(2号鸡),结果表明,0.5 mol/L NaOH溶液水解不充分,组织不能够完全分解,测得的MQCA残留量仅为49.6 μg/kg; 1.0 mol/L NaOH溶液分解组织完全,整个样品变为淡黄色溶液,MQCA测定值达159.3 μg/kg;继续增加NaOH浓度,MQCA测定值没有多大变化,且碱浓度过高(2.0 mol/L)时水解液过柱时流速变慢。因此,本实验最后选择1.0 mol/L NaOH溶液进行水解。

在优化的NaOH溶液浓度下,对水解时间进行了考察。实验表明,水解30 min,组织分解不彻底,结合态MQCA未完全解离,MQCA测定值为104.2 μg/kg(2号鸡);延长水解时间分别到45 min和60 min,组织均分解完全,无残渣剩余,MQCA测定值分别为160.5 μg/kg和162.3 μg/kg,结合态MQCA解离完全。因此最后选择60 min为氢氧化钠水解时间。

2.1.3净化方法的确定

关于喹乙醇代谢物MQCA的测定,主要采用上述3种方式水解组织试样。绝大多数文献中[13-19],酶解法通常用盐酸将水解液pH调至强酸性条件,然后和酸解法一样过MAX固相萃取小柱。而强酸性条件下,MQCA是不能够解离形成负离子,因而无法与MAX上的季铵正离子发生有效的离子相互作用,所以MQCA的回收率都非常低,本研究也验证了这种净化模式无法获得高的回收率。虽然Huang等[20,21]报道在高温下采用氢氧化钠溶液水解鸡肉组织中MQCA,但组织水解后也没有直接选择MAX混合型阴离子交换型固相萃取小柱净化,而是将水解液继续用浓盐酸调至强酸环境,再连续用乙酸乙酯、甲醇以及氯仿等有机溶剂进行液-液分配,反复萃取、净化和浓缩。操作麻烦、过程复杂,药物损失严重(见表2),且消耗大量有机溶剂,既不经济又不环保。

本研究采用氢氧化钠溶液充分水解鸡肉组织,使MQCA完全释放出来,水解液中MQCA羧基处于电离状态,可以直接与MAX小柱相互作用,获得有效保留,从而达到理想的富集、净化效果。空白鸡肉基质的典型色谱图见图1，可以看出前处理效果较好。

表 2 采用4种不同水解方法获得的鸡肉中MQCA结果比较(n=6)

ND: not detected.

2.2 基质效应

参考Achille等[22]评价MQCA测定过程中基质效应的计算方法,本研究测定了鸡肉组织中MQCA检测过程中的基质效应强度。实验结果表明,在10 μg/L浓度水平,采用文献[14]酶解法测定MQCA的基质效应为-20.5%,具有弱的离子抑制作用;酸解法[19]的基质效应为24.3%,具有一定的离子增强作用;本研究采用的碱解法将鸡肉组织完全消化,经正己烷除脂和稀释,使用MAX有效去除了大量水解产生的氨基酸和脂肪酸小分子,净化后基质效应为-18.2%,具有弱的离子抑制作用。因此,为了补偿检测过程中的基质效应,实际样品检测中既可以采用基质匹配外标曲线校正法,也可以采用同位素内标标准曲线法进行定量。

2.3 线性关系、检出限、定量限和回收率结果

在上述前处理研究的基础上,构建了基于氢氧化钠水解法结合LC-MS/MS测定鸡肉组织中MQCA残留的分析方法,方法学指标见表3和表4。

由表3数据可以看出，在1.0～100.0 μg/L范围内,MQCA的线性关系良好,相关系数(r2)大于0.99。

取空白鸡肉样品,加入低浓度MQCA标准工作液,制得一系列低浓度加标样品,按照1.3节方法处理样品,以3倍和10倍信噪比分别计算方法的检出限和定量限,结果表明,MQCA的检出限和定量限分别为0.4 μg/kg和1.0 μg/kg(见表3)。

准确称取2 g(±0.01 g)切碎样品,分别加入MQCA及其内标的混合标准工作液,制得1.0、5.0、50.0 μg/kg 3个添加水平的加标样品,每个浓度点共做6个平行,按照1.3节方法处理样品,共做3个批次,每个批次间隔一天至数天,计算分析物回收率和RSD(见表4)。结果表明:采用外标法计算,MQCA的平均回收率为71.7%～82.4%;采用内标法计算,其回收率为96.3%～103.7%, 2种方法的RSD分别为0.9%～4.5%和2.2%～6.0%。MQCA典型选择反应监测质量色谱图见图1。

图 1 MQCA和MQCA-d4的典型选择反应监测质量色谱图Fig. 1 Typical selected reactive monitoring ion chromatograms of MQCA and MQCA-d4 For MQCA: a.10 μg/L standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched standard solution. For MQCA-d4: a.10 μg/L internal standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched internal standard solution.

QuantitativemethodLinearrange/(μg/L)LinearequationCorrelationcoefficient(r2)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Externalstandard1.0-100.0y1=3.72×103x+1.37×1030.99860.41.0Internalstandard1.0-100.0y2=0.53x+6.87×10-30.99950.41.0

y1: peak area of MQCA;y2: peak area ratio of MQCA to MQCA-d4;x: mass concentration of MQCA, μg/L.

表 4 MQCA的加标回收率和精密度(n=6)

3 结论

本工作基于氢氧化钠溶液水解,混合型强阴离子固相萃取小柱直接净化,基质匹配外标曲线校正法和同位素内标标准曲线法定量,建立了简便、灵敏和可靠的液相色谱-串联质谱测定鸡肉组织中3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留分析方法。方法前处理方便、有效、经济环保,建立的方法可广泛应用于动物性食品中3-甲基喹恶啉-2-羧酸残留的日常监测。

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