温针灸对膝骨关节炎SD大鼠软骨中TNF-α和MMP-3的影响

宋昳星，郭冬梅

(新疆医科大学附属中医医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

膝骨关节炎是一种以疼痛为早期表现，随着时间的延长，可以出现关节僵硬、肿胀以及屈伸功能异常，并最终导致关节变形、行走功能丧失的慢性退行性疾病。该病的发病机制尚不明确，其中年龄、运动习惯、体质量以及遗传等因素均与其发生和发展有关[1]，而软骨的退行性改变是该病发生的核心所在，且炎症细胞因子损伤机制逐渐受到重视[2]。炎症细胞因子主要包括肿瘤坏死因子、基质金属蛋白酶、白细胞介素以及一氧化氮等，目前对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的研究最多，前者主要由单核吞噬细胞产生，对软骨细胞具有较强的分解作用，可抑制软骨基质合成[3]；后者在正常生理状态下主要以基质蛋白酶原的形式存在，但在膝骨关节炎患者中，其被过度激活，导致软骨细胞外基质蛋白分解酶过度激活，从而加速了软骨的分解和代谢，加速软骨损伤[4]。目前西医多以对症治疗为主，早期主要以患者教育、功能锻炼为主，中期主要以镇痛、消炎为主，后期则主要以关节腔注射药物、腔镜手术为主[5-6]。中医将本病归为“痹证”“筋痹”“骨痹”的范畴，治疗上有方药内治、方药外治以及针灸治疗等方法，其中针灸疗法作为中医外治的主要方法，具有操作简单、疗效确切、价廉的特点，非常适合本病的早期治疗[7]，但作用机制不明确。本研究通过动物实验，观察了温针灸对膝骨关节炎SD大鼠行为学以及软骨中TNF-α和MMP-3的影响，旨在为该病的临床治疗提供依据。

1 实验资料

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠90只，体质量200～250 g，由山东中医药大学动物实验室提供，合格证号：SCXK(鲁)2014-0025。所有动物饲养于我院实验动物实验室，饲养温度保持在(22±2)℃，湿度(60±10)%，敏感周期为12 h。自由摄水，标准饲料适应性喂养1周。

1.2主要试剂和仪器 水合氯醛(广州化学试剂厂，批号：20160223-3)；苏木精染料(天津化学试剂厂，批号：20160305-6)；甲醛(北京普博欣科技有限公司，批号：20150105-6)；二甲苯(天津化学试剂厂，批号：20160316-1)；TNF-α试剂盒(美国Sigma公司生产，购自北京定国化学生物技术有限公司，批号：LOT#035M1523V)；MMP-3试剂盒(美国Sigma公司生产，购自北京定国化学生物技术有限公司，批号：LOT#113M3652V)；离心机(德国制造，型号：5810R)；石蜡包埋机(浙江金华益迪制造，型号：YD62)；切片机(美国制造，型号：RM2235)；760日立全自动生化仪(日本制造)；放射免疫测量仪(中国制造，型号：SN-682)。

1.3分组、造模及干预 将喂养1周后SD大鼠随机分为正常组、模型组和针灸组，每组30只。模型组和针灸组大鼠参照文献[8]采取关节腔注射木瓜酶法复制右膝关节炎模型，并于造模后第4周测量左右膝关节厚度，若右膝关节较左侧肿胀大于20%，则视为造模成功。本实验中大鼠全部造模成功。然后针灸组给予温针灸治疗，选取血海、阳陵泉、内膝眼为主穴，穴位位置参照《实验针灸学》[9]。血海位于右后肢髌骨底与髌骨内侧连线上方约0.8 cm处；阳陵泉位于腓骨头下方凹陷处；内膝眼位于后肢髌骨下方，髌骨韧带内侧凹陷处。针刺前，大鼠板固定后进行穴位定位，采用太和牌0.22 mm×0.25 mm一次性针灸针，每穴刺入3～5 mm，采用平补平泻手法上下提插5次后，于针柄处粘贴一蚕豆大艾柱后点燃，持续10 min，连续针灸2周。正常组和模型组大鼠不给予任何干预。

1.4观察指标

1.4.1大鼠行为学表现 干预前后采用改良版Lequesne MG量表评估大鼠行为学表现，主要评估内容包括大鼠局部疼痛度、步态、关节肿胀情况以及关节活动范围。疼痛程度：无疼痛记0分；患肢出现收缩记1分；患肢收缩同时伴有轻度全身反应记2分；患肢聚类收缩，伴有全身颤抖甚至挣扎记3分。步态：大鼠正常行走记0分；轻度跛行，触地有力记1分；患肢参与行走，但跛行明显记2分；患肢不能参与行走记3分。关节肿胀程度：无肿胀记0分；轻度肿胀，骨性标记线变浅记1分；重度肿胀，骨性标记线消失记2分。关节活动范围：90°以上且无明显疼痛反应记0分；45°～90°且无明显疼痛反应记1分；15°～45°且无明显疼痛反应记2分；<15°且无明显疼痛反应记3分。

1.4.2大鼠软骨组织中TNF-α和MMP-3含量实验结束时采用空气栓塞法将所有大鼠处死后固定于手术台，将右后肢伸直以固定膝关节，备皮后剥离皮肤及皮下组织，暴露膝关节后，使用眼科剪与小刀片切取膝关节面软骨约20 mg，生理盐水冲洗干净后分为2份，一份标本放置于4%的甲醛中固定进行HE染色切片；另一份放置于1.5 mL试管中加入5 mL生理盐水，离心取上层清液，按照TNF-α和MMP-3试剂盒说明书，采用放射免疫法检测TNF-α和MMP-3含量。

2 结 果

2.13组大鼠干预前后Lequesne MG评分比较干预前，模型组和针灸组Lequesne MG评分均显著高于正常组(P均<0.05)。干预结束后，模型组和针灸组评分均显著下降(P均<0.05)，且针灸组评分明显低于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠干预前后Lequesne MG评分比较分)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与干预前比较，P<0.05；③与模型组比较，P<0.05。

2.23组大鼠膝关节组织病理学表现 正常组大鼠膝关节组织未发现病理改变，关节软骨表面光滑完整，各层软骨细胞排列紧密有序，见图1；模型组大鼠膝关节面粗糙不平，部分地方出现病理性裂隙，中间可见坏死性软骨组织，周围可见增生细胞及炎症细胞，见图2；针灸组大鼠膝关节病变范围小于模型组，其水肿程度、炎症浸润及坏死程度均轻于模型组，少数坏死组织区内可见新生的软骨细胞和纤维组织，见图3。

图1 正常组大鼠膝关节组织镜下表现

图2 模型组大鼠膝关节组织镜下表现

图3 针灸组大鼠膝关节组织镜下表现

2.33组大鼠膝关节组织中TNF-α、MMP-3含量比较 模型组及针灸组大鼠膝关节组织中TNF-α、MMP-3含量均明显高于正常组(P均<0.05)，但针灸组TNF-α、MMP-3含量均明显低于模型组(P均<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠膝关节组织中TNF-α、MMP-3含量比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

3 讨 论

目前膝骨关节炎的动物模型有很多，然而由于膝骨关节炎的发病机制十分复杂，多种因素均参与其中，故现有的动物模型均很难模拟膝骨关节炎的发病全过程，只是模拟了其中的一点或者一段过程[10]。木瓜蛋白酶可以使软骨基质中的多种蛋白进行分解，使蛋白多糖从软骨基质中丢失，激活骨关节的炎症反应，造成类骨关节炎的病理状态，故木瓜蛋白酶造模是目前常用的膝骨关节炎造模法之一，且成功率较高[11-12]。本研究也采用该法造模，结果均造模成功。

中医认为膝骨关节炎病因主要为肝肾不足，气血亏虚，适逢外感风寒或跌打损伤等，导致局部经络不通，不通则痛，故在治疗上宜滋补肝肾、温经通络[13]。《黄帝内经》中有云“腧穴所在，主治所及”，故本研究中取血海、阳陵泉、内膝眼三穴以疏通局部经络，恢复关节内环境平衡。血海为足太阴脾经之穴，具有滋补脾肾、益气活血之功效，为“治血要穴”，临床上常用来疏通局部经络，濡养关节，达到通则不痛、荣则不痛的目的；阳陵泉属于足少阳胆经，为八会穴之一的“筋会”，“膝为筋之府”，故选取此治筋穴以治骨病；内膝眼为治疗骨痹之经验用穴，常配合外膝眼进行透刺，但因大鼠膝关节较小难以操作，故单用此穴以促进膝关节周围气血的运行。《素问·痹论》中有“痛者，寒气多也”，提示疼痛的发生多与寒气侵蚀有关。而温针灸是一种将针刺和艾灸结合的治疗方法，具有温经散寒、通络止痛的双重作用，因此常被用来治疗膝骨关节炎[14-16]。本研究结果显示，干预结束后，模型组和针灸组Lequesne MG评分显著下降，且针灸组明显低于模型组。进一步病理观察发现，正常组大鼠膝关节组织未发现病理改变；模型组大鼠膝关节中可见广泛的病理性改变；针灸组大鼠膝关节病变范围少于模型组，且水肿程度、炎症浸润及坏死程度均轻于模型组，少数坏死组织区内可见新生的软骨细胞和纤维组织。上述结果提示温针灸不仅可改善膝骨关节炎的临床症状，而且可减轻骨关节病理改变，这与文献[17]报道相一致。

细胞因子在人体中是一种免疫调节因子，在人体各项功能中发挥着重要作用。在膝骨关节炎中，软骨细胞异常分泌了多种细胞炎症因子，这些因子被释放至细胞外基质，导致基质细胞内代谢平衡被打破，抑制软骨细胞生成的同时加速了软骨细胞的凋亡。本研究结果显示，模型组及针灸组软骨组织中TNF-α、MMP-3含量均明显高于正常组，但针灸组TNF-α、MMP-3含量均明显低于模型组。提示温针灸可能通过降低软骨细胞中TNF-α、MMP-3含量，从而起到治疗本病的作用。

综上所述，温针灸可以改善膝骨关节炎SD大鼠软骨形态，具有改善软骨退变和保护软骨的作用，可能是通过降低软骨细胞中炎症因子TNF-α、MMP-3含量来实现的。然而本次实验仅仅测定了实验结束后的TNF-α、MMP-3含量，未能对上述指标进行动态监测，温针灸治疗膝骨关节炎的作用机制有待进一步探讨。

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