沉默ADAM17蛋白对人结肠癌HT29细胞增殖能力的影响及机制探讨

张琪，杨光华，刘少鹏，丁家杉，韩学超，张国志，王长友

(1华北理工大学附属医院，河北唐山063000；2华北理工大学临床医学院；3华北理工大学医学实验中心)

结肠癌是以腺癌为主的常见消化道恶性肿瘤，在世界范围内其发病率逐年上升[1]，2015年在我国的肿瘤新发病例中排第5位[2]。恶性肿瘤的发生与细胞周期调控失常导致细胞异常增生有关，细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p21是重要的细胞周期调节蛋白。解整合素样金属蛋白酶17(ADAM17)又称肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)，主要参与肿瘤的发生发展、增殖、迁移、侵袭及远处转移[3, 4]。2017年1～6月，我们通过体外培养人结肠癌细胞HT29，构建ADAM17干扰逆转录病毒，观察ADAM17低表达后对HT29结肠癌细胞增殖能力的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞株HT29购自中国科学院干细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、胰酶(美国Gibco公司)。TRIzol、Go ScriptTM逆转录试剂盒、real-time PCR试剂盒(美国Invitrogen公司)；CCK-8试剂盒(上海贝博生物有限公司)；ADAM17抗体(美国Abcam公司)，β-actin、cyclin D1、p21抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；Annexin-V FITC/PI染料试剂盒(美国Sigma公司)；HR标记山羊抗兔IgG二抗、DAB显影液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；酶标仪(上海BIO-RAD公司)；流式细胞仪(FACS Calibuar，美国BD 公司)；垂直电泳系统、湿转系统(北京六一仪器厂)。

1.2 细胞培养与分组转染 HT29细胞用含10% FBS的DMEM培养基，在5% CO2、37 ℃孵育箱中培养。ADAM17小干扰RNA(ADAM17-shRNA)及对照序列(nonsense shRNA)由上海吉玛公司合成，其序列分别为5′-GCATCATGTATCTGAACAACG-3′、5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。将细胞分为3组，沉默组和阴性对照组分别转染ADAM17-shRNA、nonsense shRNA,空白对照组加入等量PBS，转染后48 h荧光显微镜下观察转染效率。确定MOI值为100时，细胞转染率可达90%以上。

1.3 细胞ADAM17 mRNA检测 采用real-time PCR法。收集各组细胞，TRIzol法提取RNA。通过Go ScriptTM逆转录试剂盒将RNA反转为cDNA，然后进行qRT-PCR。ADAM17引物序列上游为5′-ATCAAACCTTTCCTGCG-3′、下游为5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′，GAPDH引物序列上游为5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′、下游为5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反应条件：95 ℃变性2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；总共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算ADAM17 mRNA相对表达量。每组设2个复孔，平行实验3次。

1.4 细胞增殖能力观察 采用CCK-8 法。取各组对数生长期细胞，制成单细胞悬液；以1×104/孔接种于96孔板中(每组设9个复孔)，培养24 h后弃去培养基，加入完全培养基100 μL/孔。每孔加入CCK-8工作液10 μL后置于培养箱内继续孵育2 h，酶标仪测定在450 nm处的光密度(OD值)。同时设置空白孔、对照孔、实验孔，实验重复3次。细胞增殖率=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5 细胞周期观察 取各组对数生长期细胞，接种于6孔板；细胞同步化后胰酶消化，离心收集细胞；PBS清洗1次，然后用含75%乙醇的PBS在4 ℃固定过夜。分析前用PBS 离心洗涤细胞，加入10 mg/L 的RNase A 1 μL，37 ℃ 孵育 30 min；PI(终浓度为50 μg/mL)浸染15 min后,300目滤网过滤细胞悬液，上流式细胞仪检测。以上实验重复3次。

1.6 细胞ADAM17、cyclin D1、p21蛋白检测 采用Western blotting法。取各组细胞，RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，离心收集蛋白。BCA法定量总蛋白，加入等体积2×蛋白上样缓冲液后100 ℃变性5 min，-80 ℃保存备用。进行SDS-PAGE蛋白电泳(120 V，60 min)，转膜(90 V，45 min)，10%脱脂奶封闭，一抗摇床孵育过夜(1∶1 000) ，二抗(1∶1 000)37 ℃ 孵育2 h，荧光显色。Image J软件分析灰度值。相关蛋白表达量以所测蛋白灰度值与内参灰度值比值表示。

2 结果

2.1 各组细胞ADAM17 mRNA及蛋白表达比较 见表1。

表1 各组细胞ADAM17 mRNA及蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与阴性对照组比较，#P<0.01。

2.2 各组细胞增殖情况比较 沉默组、阴性对照组和空白对照组细胞增殖率分别为64.71%±5.14%、99.04%±2.88%、100%，沉默组细胞增殖率低于其他两组(P均<0.01)，阴性对照组和空白对照组细胞增殖率比较差异无统计学意义。

2.3 各组细胞周期比较 见表2。

表2 各组细胞周期比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与阴性对照组比较，#P<0.01。

2.4 各组细胞cyclin D1、p21蛋白表达比较 见表3。

表3 各组细胞cyclin D1、p21蛋白表达比较

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与阴性对照组比较，#P<0.01。

3 讨论

结肠癌的发生是遗传、饮食、环境、生活习惯及肠道微生态等多因素共同作用的结果，在我国发病率呈逐年上升且年轻化趋势[5]。由于相关预防保健知识的缺乏，在我国及其他发展中国家，大多数结肠癌患者在发现时已处于疾病中晚期，丧失手术机会。因此，分子靶向治疗在晚期肿瘤治疗中的运用，已经成为治疗的新关注点[6]。

近年来，ADAM17在肿瘤中的作用越来越受到关注[7]。研究[8, 9]发现，有着水解剪切酶类功能的ADAM17蛋白，在胃癌、乳腺癌等肿瘤组织中呈明显高表达状态，并可以通过MEK/ERK、PI3K/AKT等信号通路调节肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，在肿瘤的发生发展中起着重要作用。在结肠癌中，也有相关报道指出高表达的ADAM17与结肠癌的转移及预后密切相关[10]。因此，ADAM17作为一个靶向蛋白，在结肠癌的治疗中极具潜力。

无限增殖以及不受调控的细胞周期是肿瘤恶性病因之一，故肿瘤也被认为是一种细胞周期性疾病，这也是目前大多数化疗药物以及分子靶向药物研究的重点[11]。细胞周期蛋白是调节G1期与S期间调控点的关键蛋白，与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)共同调控细胞周期[12,13]。p21可以通过与CDK蛋白竞争性结合cyclin D1，导致cyclin D1/CDK激酶失活，从而产生细胞G0/G1期阻滞[14]。本研究结果显示，沉默ADAM17蛋白后，结肠癌细胞出现明显的G0/G1期阻滞，细胞周期关键蛋白cyclin D1表达显著降低，而p21的表达则明显升高。这与Lv等[15]的研究结果相符。因此，沉默ADAM17可能通过下调p21影响cyclin D1，产生对结肠癌细胞周期的抑制作用，从而阻断细胞从G1期向S期进展，造成G1期细胞堆积[16]。

综上所述，沉默ADAM17 蛋白能够抑制细胞的增殖，同时产生HT29细胞G0/G1期阻滞作用。其机制可能是通过影响细胞周期蛋白p21、cyclin D1实现对结肠癌HT29细胞周期的调控作用，但这可能并不是ADAM17调控细胞周期的惟一作用位点，其上游信号通路将在后续实验中验证。

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