枸杞多糖对围产期奶牛抗体水平和细胞因子分泌的影响

王建东，马吉锋，侯鹏霞，于 洋，梁小军

(宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002)

奶牛围产期是奶牛生产中重要的阶段，此时由于各种因素的影响导致免疫功能低下，会出现围产期免疫抑制，如果采取有效措施来提高围产期奶牛机体免疫力，整个泌乳期疾病的发病率将会降低 90%，泌乳期产奶量将有大幅提高[1]。

因此，探究围产期奶牛免疫抑制现象是奶牛围产期健康研究的一个重要议题。奶牛在围产期，机体经过妊娠、分娩等一系列生理代谢变化和日粮、环境等外界因素的变化，承受各种应激而导致免疫力下降，对病原刺激不能及时有效地做出适应性应答，表现为免疫抑制[2]。据报道，围产期奶牛的先天性和获得性免疫防御机能均降低[3]。奶牛为何在围产期出现免疫抑制机制尚不清楚，有人研究证实泌乳启动和泌乳合成是造成围产期母牛免疫抑制的一个因素[4]。试验研究指出产犊前后几周内，乳房切除的母牛与产乳的母牛比较，产乳的母牛淋巴细胞功能极大地减弱，尤其分娩时。当产犊临近时，乳房切除的母牛中性粒细胞功能减退，产犊后很快复原，而产乳奶牛产犊后中性粒细胞保持抑制状态数周，显示泌乳启动的奶牛经历的代谢挑战损害了细胞免疫功能[5]。因此，在围产期阶段，通过饲喂添加一些免疫增效剂来提高奶牛的机体免疫力是必要的。

枸杞子(LyciumbarbarumL)是宁夏当地特产，中华人民共和国兽药典(2015年版)指出宁夏的枸杞是道地药材。研究表明，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccahrides，LBP)是枸杞子主要免疫活性成分。无论是对健康动物还是对亚健康动物，LBP均能有效提高其细胞免疫和体液免疫功能。LBP可以对小鼠IL-4 、IL-3 、TNF等的诱生具有明显调节作用[6]。LBP还可以作用于T细胞、CTL细胞、NK细胞及腹腔巨噬细胞，提高机体的细胞免疫功能和免疫监视系统的功能，具有抗肿瘤和免疫调节作用。LBP还有增强红细胞免疫功能的作用[7]。关于LBP是否能提高围产期奶牛机体免疫力，目前还鲜见报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 免疫增效剂 奶牛用枸杞多糖免疫增效剂，主要成分为枸杞多糖，饲喂量为3 g/(头·d),其他成分为扩容剂。

1.1.2 试验用动物 选择体况相近围产期奶牛30头，每天饲喂同样的全价粉状饲料，自制免疫增效剂用少许的粉状饲料扩容，一次拌好7 d的量放置阴凉处，每天定时定量饲喂含有枸杞多糖免疫增效剂的饲料，试验周期7 d。试验分别在试验第0天、第7天、第14天各采血1次，将第0天作为对照组，第14、7 、0天进行对照。试验时间于2016年10月，试验地点为宁夏中宁天宁养殖场，奶牛胎龄在2胎以内。

1.1.3 主要试剂 奶牛免疫球蛋白G(IgG) (批号：20160812)、免疫球蛋白M(IgM)(批号：20160815)、免疫球蛋白A(IgA)(批号：20160812)、白细胞介素2(IL-2)(批号：20160816)、白细胞介素13(IL-13)(批号：20160813)、白细胞介素9(IL-9)(批号：20160816)、白细胞介素17(IL-17)(批号：20160812)、γ干扰素(IFN-γ)(批号：20160815)、肿瘤坏死因子β(TNF-β)(批号：20160818)等9项指标的定量检测卡，R&D公司产品。

1.1.4 主要仪器 酶标仪(SM-3)，北京天石天力公司产品；自动洗板机(ST360W)，上海科华公司产品；电热恒温器(HH-W21-600)，天津泰斯特有限公司产品；离心机(TDL80-2B)，上海安亭科学仪器有限公司产品；血常规分析仪(XFA6130型)，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试验牛处理方法 试验牛不进行分组，采用第0、7、14天进行组内比较。

1.2.2 血样采集 各组尾静脉采血0.5 mL，室温放置1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，然后于2 000 r/min离心10 min，收集血清。

1.2.3 奶牛血常规检测 分别在试验开始前、饲喂第7天后、饲喂结束跟踪到第14天后各采血1次，利用血常规分析仪进行分析，测定白细胞和淋巴细胞。

1.2.4 外周血液各种免疫因子含量的检测 分别在试验开始前、第7天、第14天采血0.5 mL，室温放置1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，然后于2 000 r/min离心10 min，收集血清，IgG、IgM、IgA、IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β含量严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作检测。

1.2.5 数据统计分析 试验结果用Spss13.0进行统计分析。

2 结果

2.1 枸杞多糖免疫增效剂对围产期奶牛抗体水平和细胞因子分泌的影响

由表1可见，饲喂后7 d，IgA、IgM、IgG含量开始上升到最高，接着下降。统计分析表明，饲喂后7 d，IgA含量显著高于0 d(P<0.05)，IgM、IgG含量极显著高于0 d(P<0.01)，跟踪14 d的含量与0 d的差异不显著，但均高于0 d的值。

由表2可见，饲喂后7 d，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19、TNF-α和IFN-γ含量开始上升到最高，接着下降；统计分析表明，在饲喂7 d后， IL-2、IL-13、IL-17、IL-19的含量均极显著高于0 d(P<0.01)； TNF-α和IFN-γ在饲喂7 d和跟踪14 d的含量均极显著高于0 d(P<0.01)，表明饲喂7 d即可提高细胞因子水平。

通过表1和表2可以看出围产期奶牛抗体水平和细胞因子分泌的消长规律，即7 d是高峰，接着开始下降。枸杞多糖免疫增效剂饲喂量为3 g/(头·d)，时间为7 d可以提高围产期奶牛抗体水平和细胞因子的分泌。

表1 枸杞免疫增效剂对奶牛免疫球蛋白含量的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，未标字母或字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note:The different upper letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the different lower letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the same letters indicates no significant differences(P>0.05).

表2 枸杞免疫增效剂对奶牛细胞因子含量的影响

注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，未标字母或字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note:The different upper letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the different lower letters in same row indicates significant differences(P<0.01),the same letters indicates no significant differences(P>0.05).

2.2 枸杞多糖免疫增效剂对围产期奶牛白细胞和淋巴细胞的影响

通过血液常规检测奶牛白细胞、淋巴细胞，可以间接了解枸杞多糖免疫增效剂对提高奶牛机体免疫力效果，分析结果见表3。从表3可以看出，白细胞在饲喂中、饲喂后与饲喂前差异不显著(P>0.05)，但饲喂后是饲喂前的1.04倍；淋巴细胞在饲喂后与饲喂前差异不显著(P>0.05)，但饲喂后是饲喂前的1.01倍。

表3 枸杞免疫增效剂对奶牛白细胞和淋巴细胞的影响

3 讨论

3.1 枸杞多糖对围产期奶牛体液免疫功能的影响

奶牛围产期外周血中免疫球蛋白含量的高低能反映奶牛在该时期的免疫力，免疫球蛋白可以间接反应动物机体的体液免疫功能。李刚诗等[8]研究奶牛围产期血清中IgG、 IgA、 IgM含量均先降低后升高，与分娩当天相比，产前21 d时三者含量是减少的，而产后21 d时其含量仍未恢复到产前21 d时的水平。初乳中IgG、IgA、IgM含量随泌乳时间的延长逐渐降低。本试验分别在围产期阶段选择试验开始前、7天后、14天后各采血1次，检测外周血中IgG、IgA、IgM含量的变化，从而反映该时期奶牛免疫状态。饲喂后7 d，IgA含量显著高于0 d(P<0.05)，IgM、IgG含量极显著高于0 d(P<0.01)，跟踪14 d的含量与0 d的差异不显著，但均高于0 d的值。奶牛在围产期阶段处于免疫抑制状态，表现为产前免疫球蛋白的减少和分娩前后低水平的免疫球蛋白，这些变化可能是导致围产期奶牛较高发病率的原因之一，据张银[9]研究报道，围产前期添加植物提取物可提高围产期奶牛血清中IgG、IgM、IgA的含量，但差异不显著，同时对初乳中的IgM、IgA含量有提高的趋势。本试验研究说明在奶牛围产期阶段饲喂枸杞多糖，可提高奶牛围产期外周血中免疫球蛋白含量。

3.2 枸杞多糖对围产期奶牛细胞免疫功能的影响

据研究有些细胞因子在临近分娩时升高，分娩后下降。有些在临近分娩时下降，分娩后升高，但通过中药免疫增强剂可以极显著提高血清中某些细胞因子[10]。本试验分别在围产期阶段试验开始前、第7天、第14天各采血1次，检测外周血中IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β含量的变化，从而反映该时期奶牛机体免疫状态，在饲喂第7天，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19的含量均极显著高于0 d(P<0.01)；TNF-α和IFN-γ在饲喂7 d和14 d的含量均极显著高于0 d(P<0.01)，表明饲喂7 d即可提高围产期奶牛相关细胞因子。

3.3 枸杞多糖对围产期奶牛白细胞和淋巴细胞的影响

李刚诗等[8]研究奶牛围产期血液中的细胞，临近分娩和分娩后，奶牛外周血的白细胞、淋巴细胞呈持续下降趋势，主要原因就是免疫抑制。本试验通过在围产期饲喂枸杞免疫增效剂，结果表明白细胞在饲喂中、饲喂后与饲喂前差异不显著(P>0.05)，但饲喂后是饲喂前的1.04倍；淋巴细胞在饲喂后与饲喂前差异不显著(P>0.05)，但饲喂后是饲喂前的1.01倍。说明枸杞多糖具有提高围产期奶牛免疫力的作用。

参考文献：

[1] Moreira T F,Zambrano J U，Vitor M D,et al .Serum mineral profile of Girolanda cows during transition period in semi-intensive system in two seasons[J].Pesq Vet Bras，2015，35(3):249-257.

[2] 李国鹏.围产期奶牛低血糖症、高酮血症、亚临床低钙血症血液生化指标的监测[D].吉林长春:吉林大学,2016.

[3] Crookenden M A,Walker C G,Heiser A,et al .Effects of precalving body condition and prepartum feeding level on gene expression in circulating neutrophils[J].J Dairy Sci,2017,100(3):2310-2322

[4] 弓 剑，晓 敏.围产期奶牛免疫功能障碍及其发生原因[J].中国饲料，2016，14(4):15-18

[5] 徐丹丹，杨 彬，王建发,等.围产期奶牛乳房炎与E2、P4免疫调节作用及TLRs、 NLRs介导天然免疫三者间的关系[J].中国兽医学报,2016,36(8):1455-1458.

[6] Kevin K P,Joseph W L,Jackie N C,et al.Protective effect of Lycium Barbarum polysaccharides on dextromethorphan-induced mood impairment and neurogenesis suppression[J].Brain Research Bulletin,2017,134(9):10-17

[7] 刘英娟,杜金梁,贾 睿,等．枸杞多糖对四氯化碳致建鲤急性肝损伤的保护作用[J]． 浙江农业学报，2015，27(1):37-43．

[8] 李刚诗,王晓艳,袁 听,等.围产期健康奶牛血清和初乳中免疫球蛋白含量的变化[J].中国兽医学报,2015,35(2):273-277.

[9] 张 银.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十二次动物营养学术研讨会论文集[M].北京：中国社会科学出版社，2016.

[10] 孙跃博.中药方剂对围产期奶牛免疫功能和泌乳性能影响的研究[D].新疆石河子：石河子大学，2016.