当归补血颗粒的质量标准研究

李思聪，李旭廷*，李金良，张敏，王 斌，杨 锐

(1.四川省畜牧科学研究院兽药研究所，四川成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川成都 610066；3.四川鼎尖动物药业有限责任公司，四川成都 610100)

当归补血汤系中医经典名方，始载于李东垣的《内外伤辨惑论》，按黄芪∶当归(5∶1)组成，具补气生血等功效，多用于治劳倦内伤，气弱血虚，阳浮于外之虚热证[1]。现代医学研究发现其具有改善血液系统功能，调节机体免疫、保肝、抗氧化等作用[2]。阿魏酸是当归中的主要活性成分，具有扩张血管、抗血小板凝集、抗血栓、清除亚硝酸盐、清除氧自由基、抗菌、抗肿瘤、增强免疫等药理作用[3-5]。藁本内酯是当归中的主要挥发性成分，研究报道，藁本内酯具有抗细胞凋亡，减轻氧化应激性损伤、扩张血管、抗血栓、抗血凝、改善微循环等作用[6-8]。黄芪甲苷是黄芪主要活性成分之一，具有增强巨噬细胞吞噬功能，调节免疫、降血糖、降血脂、抗细胞凋亡、抗炎、抗病毒等作用[9-11]。

当归补血颗粒是在当归补血汤的基础上，结合兽医临床携带方便，便于贮藏的要求，经过现代提取、制剂工艺加工而成的中药颗粒剂。兽医临床上拟用于老龄蛋鸡气血双虚、产蛋性能下降等证。为了更好地对当归补血颗粒质量进行检测、评价和控制，本试验按照农业部《新兽药研制管理办法》[12]、《兽用中药、天然药物质量标准分析方法验证指导原则》[13]的相关要求，对其进行了薄层鉴别和含量测定的系统研究，为制定当归补血颗粒的质量标准，进而申报国家三类新兽药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备 ZF-1型三用紫外分析仪，上海精科实业有限公司产品；LC-10Avp高效液相色谱仪、SPD-10Avp检测器，日本岛津制作所产品；UM5000蒸发光散射检测器，上海通微分析技术有限公司产品；Alltima C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm)，美国奥泰科技有限公司产品；浙大N2000色谱工作站，智达信息工程有限公司产品； BP211D分析天平，德国Sartorius公司产品；KQ218型超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品。

1.1.2 药品、试剂与耗材 供试品及阴性样品，四川鼎尖动物药业有限责任公司试制；对照品藁本内酯(批号111737-201608)、阿魏酸(批号110773-201614)、黄芪甲苷(批号110781-201616)，中国食品药品检定研究院产品；用于液相色谱的甲醇、乙腈均为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯试剂；硅胶G薄层板及硅胶GF254薄层板(规格100 mm×200 mm，厚度0.20 mm～0.25 mm)，青岛海洋化工厂产品。

1.2 方法

1.2.1 藁本内酯的薄层鉴别 称取当归补血颗粒样品2 g，加入4 mL水充分混匀，置分液漏斗中，用石油醚(30℃～60℃)振荡提取5次，每次10 mL，合并石油醚液，挥干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液，同法制得阴性样品溶液。另取藁本内酯对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取供试品溶液10 μL，阴性样品溶液10 μL和对照品溶液5 μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，以正己烷∶乙酸乙酯(9∶1)为展开剂，展开，取出，晒干，置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.2.2 含量测定

1.2.2.1 阿魏酸的HPLC检测

(1) 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.85 g/L磷酸溶液(17∶83)为流动相；检测波长为316 nm；柱温40℃。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于4 000

(2) 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定量制成每1 mL含50 μg的对照品储备溶液。再精密吸取该溶液1 mL于10 mL棕色容量瓶内，以甲醇定容至刻度，摇匀，制得5 μg/mL的标准溶液。

(3) 供试品及阴性样品溶液的制备 取当归补血颗粒供试样品0.5 g，精密称定，置于50 mL棕色容量瓶中，加入1 mL水充分混匀后，加甲醇稀释至刻度，摇匀，超声10 min，滤过，取续滤液，得供试品溶液，同法制得阴性样品溶液。

(4) 线性关系及标准曲线 精密称取阿魏酸对照品5.015 mg于100 mL棕色容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为50.15 μg/mL的对照品储备溶液。分别精密吸取该溶液4、2、1、0.5、0.2、0.1 mL于10 mL棕色容量瓶内，以甲醇定容至刻度，摇匀制得20.06、10.03、5.015、2.508、1.003、0.502 μg/mL的标准溶液，进样量20 μL，HPLC法测定，绘制标准曲线，并做线性回归。

(5) 精密度试验 精密配制低、中、高3种浓度(1.003、10.03、20.06 μg/mL)的阿魏酸对照液各3份，按照上述色谱条件分别进样20 μL，HPLC法测定，计算含量RSD。

(6) 重复性试验 同一批次当归补血颗粒样品6份，每份取0.5 g，精密称定，参照1.2.2.1(3)项下方法制备，进样量20 μL，HPLC法测定，计算含量RSD。

(7) 稳定性试验 取同一供试品，参照1.2.2.1(3)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，置于室温避光放置0、2、4、6、8、12 h后，精密吸取20 μL，HPLC法测定，计算含量RSD。

(8) 回收率试验 取已知含量的同一批次当归补血颗粒样品9份，每份取0.5 g(阿魏酸含量：0.222 5 mg/g)，精密称定，置50 mL容量瓶中，加入1 mL水充分混匀后，分别精密加入5 mL阿魏酸对照品溶液(20.06 μg/mL)，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，超声10 min，滤过，取续滤液，进样量20 μL，HPLC法测定，计算回收率。

回收率=(阿魏酸测定量-样品中阿魏酸原含量)/阿魏酸加入量×100%

(9) 专属性试验 分别吸取对照品、供试品，阴性样品溶液各20 μL进样，记录色谱峰。

(10) 供试品阿魏酸含量测定 当归补血颗粒供试品3批，各批次取平行样3份，参照1.2.2.1(3)项下方法制备，分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液和阴性样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，HPLC法测定，以外标法计算样品中阿魏酸的含量。

1.2.2.2 黄芪甲苷的检测

(1) 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-水(36∶64)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

(2) 对照品溶液的制备 称取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置于100 mL棕色容量瓶内，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.40 mg/mL的对照品溶液。

(3) 供试品及阴性样品溶液的制备 取本品约5.0 g，精密称定，加10 mL蒸馏水溶解，用水饱和正丁醇提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，加氨试液30 mL，振摇，过夜，分取正丁醇液，蒸干，残渣用甲醇适量使溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。

(4) 线性关系及标准曲线 精密称取黄芪甲苷对照品40.08 mg于5 mL棕色容量瓶内，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为8.016 mg/mL的对照品储备溶液。分别精密吸取该溶液1、0.5、0.3、0.2、0.1 mL于2 mL棕色容量瓶内，以甲醇稀释至刻度，摇匀制得4.008、2.004、1.202、0.802、0.401 mg/mL的标准溶液，另取对照品储备溶液，分别精密吸取10 μL，注入色谱仪，HPLC法测定，以峰面积自然值(y)为纵坐标，黄芪甲苷浓度自然对数值(x)为横坐标，绘制标准曲线，并做线性回归。

(5) 精密度试验 分别取黄芪甲苷对照品溶液低、中、高3种浓度(0.401、1.202、8.016 mg/mL)的黄芪甲苷对照液各3份，按照上述色谱条件分别精密吸取10 μL，注入色谱仪，HPLC法测定，计算含量相对标准偏差(RSD)。

(6) 重复性试验 取同一批次当归补血颗粒样品6份，参照1.2.2.2(3)项下方法制备，精密吸取10 μL，注入色谱仪，HPLC法测定，计算含量RSD。

(7) 稳定性试验 取同一供试品，参照1.2.2.2(3)供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别置于室温避光放置0、2、4、6、8、12 h后，精密吸取10 μL，注入色谱仪，HPLC法测定，计算含量RSD。

(8) 加样回收率试验 取已知含量的同一批次当归补血颗粒样品9份，每份约取5.0 g(黄芪甲苷含量：0.942 2 mg/g)，精密称定，再分别精密加入1 mL黄芪甲苷对照品溶液(4.008 mg/mL)，按照1.2.2.2(3)项方法处理样品，滤过，取续滤液，得供试品溶液。进样量10 μL，HPLC法测定，计算回收率。

回收率=(黄芪甲苷测定量-样品中黄芪甲苷原含量)/黄芪甲苷加入量×100%

(9) 专属性试验 分别吸取黄芪甲苷对照品10 μL、20 μL和供试品溶液，阴性样品溶液各10 μL，注入色谱仪，HPLC法测定，计算样品中黄芪甲苷的含量。

(10) 供试品黄芪甲苷的含量测定 当归补血颗粒供试品3批，各批次取平行样3份，参照1.2.2.2(3)项下方法制备，分别吸取黄芪甲苷对照品10 μL、20 μL和制备好的供试品 10 μL，注入液相色谱仪，HPLC法测定，以外标两点法对数方程计算，即得。

2 结果

2.1 藁本内酯的薄层鉴别结果

由藁本内酯的薄层鉴别结果表明，供试品色谱中在与藁本内酯对照品色谱相应位置显相同颜色的斑点；阴性样品色谱中在与对照品色谱斑点相应位置没有斑点(图1)。综上所述，阴性对照样品对藁本内酯的鉴别没有干扰，该薄层色谱方法鉴别藁本内酯专属性强。

2.2 含量测定结果

2.2.1 阿魏酸的HPLC检测结果

2.2.1.1 线性关系及标准曲线结果 阿魏酸线性回归方程：y=49 134x+6 493.5，R2=0.999 5(图2)。结果表明，阿魏酸在0.502 μg/mL～20.06 μg/mL浓度间具有良好的线性关系。

1.藁本内酯对照；2～4.样品；5.阴性对照

1.Ligustilide reference;2-4.Samples;5.Negative control

图1当归补血颗粒中藁本内酯的TLC图

Fig.1 TLC ofLigustilide

图2 阿魏酸标准曲线

2.2.1.2 精密度试验结果 3种浓度阿魏酸对照液精密度RSD分别为1.24%、1.35%、1.26%，均不大于1.5%，表明本法精密度良好。

2.2.1.3 重复性试验结果 6份当归补血颗粒中，测得阿魏酸的含量分别为0.221 3、0.224 3、0.222 7、0.220 4、0.222、0.223 3 mg/g，RSD=0.63%，表明本方法重复性良好。

2.2.1.4 稳定性试验结果 当归补血颗粒溶液室温分别放置0、2、4、6、8、12 h，测得阿魏酸含量分别为0.225 4、0.221 2、0.219 9、0.220 9、0.223 9、0.223 1 mg/g，RSD=0.93%，表明供试品溶液在12 h内含量稳定。

2.2.1.5 加样回收率结果 9次测得当归补血颗粒的回收率平均值为98.21%，测定的相对标准偏差RSD=3.82%，说明该方法准确可信(表1)。

2.2.1.6 专属性试验结果 由图3～图5可以看出，当归补血颗粒供试品中阿魏酸与相邻杂质峰分离良好，阴性样品在阿魏酸处无吸收，不干扰本品测定。

2.2.1.7 供试品阿魏酸含量测定结果 结果表明，3批供试品中阿魏酸含量分别为0.213 2、0.202 8、0.221 8 mg/g，平均为0.212 6 mg/g(表2)。

表1 3批样品回收率测定结果

2.2.2 黄芪甲苷的HPLC检测结果

2.2.2.1 线性关系及标准曲线 黄芪甲苷线性回归方程：LnA=1.191 2(LnC)+4.821，R2=0.999 2(图6)。在0.401 mg/mL～8.016 mg /mL浓度间，本法的线性良好。

2.2.2.2 精密度试验 3种浓度黄芪甲苷对照品溶液精密度RSD分别为1.23%、1.41%、0.84%，均不大于1.5%，表明本法精密度良好。

2.2.2.3 重复性试验 6份当归补血颗粒测得黄芪甲苷含量分别为0.958 9、0.937 3、0.944 4、0.956 2、0.912 6、0.943 8 mg/g，RSD=1.76%，表明本方法重复性良好。

图3 对照品阿魏酸色谱图

图4 供试品阿魏酸色谱图

图5 阴性对照色谱图

批次Batch含量/(mg·g-1)Content123平均含量/(mg·g-1)Averagecontent10.21130.21250.21580.213220.20150.20260.20450.202830.22310.22140.22080.2218

图6 黄芪甲苷标准曲线

2.2.2.4 稳定性试验 当归补血颗粒溶液室温分别放置0、2、4、6、8、12 h，测得黄芪甲苷含量分别为0.932 8、0.936 8、0.959 2、0.951 6、0.914 3、0.939 3 mg/g， RSD=1.66%，表明供试品溶液在12 h内含量稳定。

2.2.2.5 加样回收率试验 9次测得当归补血颗粒黄芪甲苷的回收率平均值为97.68%，测定的相对标准偏差RSD=4.15%(表3)，说明该方法准确可信。

表3 3批样品回收率测定结果

2.2.2.6 专属性试验 由图7～图10可以看出，当归补血颗粒供试品中黄芪甲苷与相邻杂质峰分离良好，阴性样品在黄芪甲苷处无吸收，不干扰本品测定。

图7 黄芪甲苷对照品色谱图(10 μL)

图8 黄芪甲苷对照品色谱图(20 μL)

图9 供试品黄芪甲苷色谱图

图10 阴性对照色谱图

2.2.2.7 供试品黄芪甲苷的含量测定 结果表明，3批供试品中黄芪甲苷含量分别为0.928 0、0.917 2、0.939 3 mg/g，平均为0.928 2 mg/g(表4)。

表4 3批供试品黄芪甲苷含量

3 讨论

藁本内酯是当归中的主要挥发性成分，在薄层色谱中具有很强的亮兰色荧光，是目前当归鉴别常用的特征斑点[14-15]。在进行藁本内酯薄层鉴别研究中，分别参考了《中国药典》(2015年版，一部)[16]“当归”药材和“当归流浸膏”项下的提取方法。其中，“当归”药材项下需使用乙醚作为藁本内酯的提取溶剂，然而乙醚属于易制毒化学品，受国家管控，购买不便，故参照“当归流浸膏”项下的鉴别方法用石油醚(30℃～60℃)进行提取。在薄层色谱板选择上，开始参照药典方法使用硅胶G薄层板，但供试品荧光斑点不清晰，改用硅胶GF254薄层板，结果斑点清晰。另外，从节约对照品角度出发，经优化，将对照品点样量调整为5 μL(药典为10 μL)，对照品荧光斑点清晰，亮度适中，可用于藁本内酯薄层色谱鉴别。

在对当归补血颗粒阿魏酸含量测定研究中，参考《中国药典》(2015年版，一部)“当归流浸膏”含量检测项进行供试品溶液的制备，但在操作中，由于颗粒剂黏度较大，直接加入甲醇后无法均匀分散，经超声处理后效果也不明显，在经反复优化后，决定在加入甲醇稀释前，预加1 mL水使颗粒剂充分分散，加入甲醇稀释至刻度后，再进行超声处理10 min使阿魏酸充分溶于甲醇。阿魏酸含量测定色谱条件分别参考中国药典 “当归”药材含量测定项和“当归流浸膏”含量测定项下的方法进行测定。其中“当归流浸膏”采用梯度洗脱法进行阿魏酸的含量测定，这在实际检测中需要使用带有二元及以上梯度泵的高效液相色谱仪，增加了检测投入成本。本着节约成本、简便、易操作的原则，在不影响阿魏酸测试精确性及稳定性等条件下，本研究最终参照 “当归”含测项色谱条件进行当归补血颗粒阿魏酸的含量测定。

当归补血颗粒黄芪甲苷的含量测定研究中，分别参考《中国药典》(2015年版，一部)“黄芪”药材和“当归补血口服液”含测项下的方法进行供试品溶液的制备。其中“黄芪”药材中供试品溶液制备在经氨试液洗涤后需要用不同浓度的乙醇进行大孔吸附树脂富集纯化3次，增加了制备操作流程，因此，在对当归补血颗粒黄芪甲苷含测研究中，选择“当归补血口服液”黄芪甲苷含测供试品制备方法进行制备，简化了操作步骤，避免因繁复的操作给定量分析带来的操作误差。同时，参照该法对当归补血颗粒黄芪甲苷供试品溶液制备、测定、HPLC分析色谱峰型良好，专属性高，可用于当归补血颗粒中黄芪甲苷的含量测定。

本研究采用薄层色谱法(TLC)对组方药物当归有效成分藁本内酯进行鉴别，薄层色谱斑点清晰，分离度好，特异性强，阴性对照无干扰；采用高效液相色谱法(HPLC)分别对组方药当归中的有效成分阿魏酸和黄芪中的有效成分黄芪甲苷进行含量测定，方法精密性、重复性、稳定性良好，阿魏酸，黄芪甲苷色谱图中阴性对照均无干扰，专属性良好。以上所确定的TLC鉴别和HPLC含量测定方法可对当归补血颗粒的质量进行有效控制，为进一步制定质量标准奠定了基础。

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