IL-35在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理的关系

陈艳玲

(1、南昌大学医学院，南昌 330006；2、江西省胸科医院呼吸二科，南昌 330006)

在全球范围内，肺癌的发病率和病死率均位居恶性肿瘤之首，其中，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer、NSCLC)的发生率约占80%以上。据统计世界各地每年因肺癌死亡的人数在150万左右[1，2]。尽管NSCLC的治疗效果较前有大幅度的提高，但其5年生存率仍未见明显提高，约在15%左右[3]。当前，肺癌的确诊主要根据组织细胞学检查，但是该检查方法的创伤较大，并且容易发生并发症。血清中肿瘤标志物的测定具有取材便捷、检测方便、易重复等诸多特点，并且在肿瘤的筛查、诊断、分型及预后等方面有重要的参考价值[4]。IL-35(interleukin-35，IL-35)是IL-12家族的最新成员，由EB13及P35亚基组成的异源性二聚体[5]。当前，研究者证实IL-35在多种肿瘤细胞中高表达，包括胃癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、B细胞淋巴瘤、鼻咽癌及黑色素瘤[6]。但IL-35与NSCLC相关性研究相对较少，评价IL-35在肿瘤患者体内的检测水平及其作用具有重要的临床意义。本研究运用RT-PCR检测NSCLC患者肺癌组织中IL-35的表达水平，应用酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA） 分析肺癌患者血清中IL-35的表达与NSCLC患者临床病理因素之间的联系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾分析我院2016年7月至2017年9月期间收治的78例经手术、支气管镜活检或者穿刺肺活检后病理诊断为NSCLC患者的治疗情况，其中男 42 例，女 36 例，年龄(45．6±13.7)岁，我们在取样本前详细记录并核对相关资料，如患者姓名、性别、年龄、住院号、联系方式、发病时间、病理诊断、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、肿瘤是否有淋巴转移、手术时间与方式、原发或复发等。根据患者病理分为肺鳞癌40例及肺腺癌38例，选取手术治疗患者20例，其中肺鳞癌及肺腺癌患者各10例，取得这些患者的癌组织及癌旁组织，并收集手术7d后患者血清，同时期来我院体检健康人群20例作为对照组，本研究均在患者及健康体检者知情同意后进行，并取得了我院伦理委员会的同意。纳入标准：所纳入的患者手术前均未经抗肿瘤治疗；所有患者均经病理或细胞学诊断为非小细胞肺癌患者。排除标准：原发肿瘤的肺部转移；伴有其他并发症如肺部炎症、糖尿病等；伴有免疫性疾病患者；伴有血液系统疾病患者；未签署知情同意者或我院伦理委员会未同意者；随访资料不完善的患者。

1.2 标本采集及分组

1.2.1 RT-PCR检测标本 收集20例经手术切除肿块的NSCLC组织及其癌旁组织来自本院胸外科，癌组织标本离体后，选取肿块组织非坏死部分，癌旁组织取距肿瘤至少2.5cm的肺组织，标本均取自术后1h以内，取下后迅速液氮保存备用。

1.2.2 血清标本的收集与保存 NSCLC患者于入院后24h内和健康体检者空腹采用非抗凝真空管采取外周静脉血5ml，室温放置60min后，离心机以6000rpm/min，离心10min，然后取经离心后的患者血清放入2ml无菌的EP管中，-20℃低温保存备用。1.2.3实验分组 RT-PCR分组：NSCLC癌组织20例 （肺鳞癌、肺腺癌各10例）与癌旁组织20例；ELISA分组：肺癌组：肺鳞癌组40例、肺腺癌组38例，健康体检对照组20例；手术前肺癌组、手术后肺癌组（该20组患者均为手术治疗的肺癌患者）

1.3方法

1.3.1 检测方法 ⑴所有患者于术前清晨空腹抽取外周静脉血5ml，于6000rpm/min的离心分离机离心分离10min，置于冰箱保存待检；⑵采用ELISA法检测患者血清IL-35水平（严格按照试剂说明书进行相关操作），记录分析。

1.3.2 采用Trizol提取法提取20例NSCLC组织和相应癌旁肺组织中总RNA后，进行逆转录，再应用PCR进行扩增，所有实验操作步骤都是严格按照逆转录试剂盒及PCR mix试剂盒使用说明书进行操作

qRT-PCR分析基因表达

EBI3引物P35引物β-actin引物上游下游上游下游上游下游5’-GCTCCCTACGTGCCTCAATGT-3’5’-CCCTGACGCTTGTAACGGAT-3’5’-TCCTCCCTTGAAGAACCGGA-3’5’-TGACAACGGTTTGGAGGGAG-3’5’-CCTGGCATGGAGTCCTGTG-3’5’-AGGGGCCGGACTCGTCATAC-3’

PCR总反应体系为20.0μl，内含2xPremix Ex Taq RNA 10.0μl， 上下游引物各 0.4μl，cDNA 2.0μl，其余加双蒸水补足扩增。条件为94℃预变性2min，94℃ 20s，60℃ 34s， 温度转换率均为 20℃30s扩增40个循环，70℃延伸时采集荧光信号，所有样品均做复孔，IL-35的相对表达量用2-ΔΔCT法表示。

1.4 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行统计学的分析，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料采用t检验，等级资料的比较采用秩和检验，(P＜0.05)则表示两组差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在mRNA水平检测NSCLC组织中IL-35的表达 在mRNA水平检测20例NSCLC癌组织中IL-35表达水平，IL-35在NSCLC组织中的表达情况，肺鳞癌中 IL-35 表达量为（34.22±0.996）ng/ml，肺腺癌中 IL-35 表达量（32.00±0.906）ng/ml，比正常癌旁组织中的（12.70±0.230）ng/ml显著增高，并且两者之间的差异有统计学意义 （P＜0.0001）。在NSCLC中，肺鳞癌组织中IL-35的表达量高于肺腺癌，差异有统计学意义（P<0.05）。

图1 IL-35 mRNA在NSCLC癌组织中的表达量

2.2 NSCLC患者血清中IL-35水平比较 通过EILSA对78例NSCLC患者及20健康体检者血清中IL-35的检测发现，肺鳞癌、肺腺癌、健康体检者血清中 IL-35 水平分别是 （36.68±3.19）ng/ml、（34.32±3.86）ng/ml和（16.72±4.59）ng/ml，通过对比分析发现在NSCLC患者血清中IL-35的水平明显高于健康体检者，二者之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。在肺腺癌与肺鳞癌患者血清中IL-35水平相比，我们发现鳞癌患者血清中IL-35水平比腺癌患者血清中高，但其差异无统计学意义（P=0.514）（见图2）；通过对20例手术前后肺癌患者血清中IL-35的检测发现手术前患者血清中IL-35的表达量明显高于术后，差异有统计学意义（P＜0.0001）（见图 3）

图2 NSCLC患者血清中IL-35的表达量

图3 手术前后肺癌患者血清中IL-35的表达量

2.3 NSCLC患者血清中IL-35水平与其病理特性的关系 通过酶联免疫吸附法检测78例NSCLC患者血清中IL-35水平变化，分析结果见表3。我们发现NSCLS患者血清中IL-35的水平的与患者的年龄、性别及原发肿瘤的大小之间没有统计学意义（P＞0.05）；而与肿瘤的分化程度、TNM 分期之间的有显著性差异（P＜0.05）。在随后的分析发现，在肿瘤的分化程度中，IL-35与随着肿瘤的分化程度成正比；在肿瘤的TNM分期中，肿瘤分期越高，IL-35表达量越高。伴有淋巴结转移的NSCLC患者血清中IL-35水平较无淋巴结转移者高。由此，我们可认为血清中IL-35的表达量与NSCLC的分化程度、TNM分期及淋巴结转移呈正相关，而与患者的年龄、性别及原发肿瘤的大小则没有相关性。

3 讨论

据IARC统计，预计到2025年时，我国每年新增肺癌患者将达100万例[7]。当前，由于医疗技术的不断的完善，包括最新的靶向药物治疗，但NSCLC患者5年生存率仍然不容乐观，早发现、早治疗仍是提高患者生存率的主要手段之一，此外，对于肺癌患者及时有效的治疗及预后的判断显得至关重要，但目前仍无行之有效的生物学指标。

2007年，国外学者首次发现一种由CD4+CD25+调节性T细胞分泌的额新型抑炎性细胞因子，并将其命名为白介素35(interleukin-35，IL-35)[8]。IL-35通过表达于细胞上受体IL-35R发挥作用。在结直肠癌中，高表达IL-35可诱导Treg细胞进入肿瘤微环境从而促进肿瘤生长，同时还检测了肺癌、结直肠癌及肝癌等多种肿瘤细胞系中IL-35的表达，均发现IL-35的两个亚基P35及EB13共表达，当给予外源性的IFN-γ及TNF-α刺激后，肿瘤细胞表达IL-35的量增加[9]。在体外的细胞实验中发现，上调IL-35的表达后，cyclinB、cyclin D及cdk4的表达随之增加，同时下调p27的表达，促进了胰腺癌细胞的增殖，进而促进胰腺癌病程的进展[10]。通过构建稳定过表达IL-35的肿瘤细胞系，发现过表达IL-35导致肿瘤停滞在细胞G1期，抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡，可以引起Fas基因的表达上调及Cyclin D1、Survivin及Bcl-2基因表达水平的下调[11]。但是，也有不同的研究结果，在乳腺癌的的研究中，IL-35被认为具有抑制肿瘤的特性[12]。

表1 外周血IL－35表达与NSCLC患者临床特征的关系

在本研究中，我们通过检测NSCLC患者中血浆及癌组织中IL-35的表达量，并分析血清中IL-35与患者临床病理特征之间的联系。结果分析发现：第一，NSCLC患者癌组织及血浆中IL-35的表达量明显高于癌旁及健康体检者，在癌组织中的IL-35的表达量与肺癌的组织类型显著相关，肺鳞癌中IL-35高于肺腺癌，且差异有统计学意义；但是在血清中的检测结果显示，他们之间无统计学意义；分析其结果，可考虑为统计样本导致，亦或是由于检测方法的不同导致；第二，IL-35的表达量与患者是否发生淋巴结转移、分化程度及TNM密切相关，肿瘤的分化程度中，IL-35与肿瘤的分化程度成正比；在肿瘤的TNM分期中，肿瘤分期越高，IL-35表达量越高。伴有淋巴结转移的NSCLC患者血清中IL-35水平较无淋巴结转移者高。该结果与Gu等[13]研究结果较为一致，他们认为IL-35与NSCLC疾病的进程及淋巴结转移密切相关。但在本研究中发现NSCLC患者的血清中IL-35的表达量与分化程度密切相关，这与Gu研究结果不符，考虑为在研究过程中由于样本量的差异导致，故如需获得更加严谨及准确的结果，仍需更大样本、从多方位来验证本结果。

参考文献

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