HSP90靶向抑制剂P7与多西紫杉醇联用对三阴性乳腺癌细胞的协同抗肿瘤作用

范姝婕，刘俊雅，王 俊，刘娜斯，黄 薇，杨 楠，刘雁勇

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 药理学系，北京 100005)

三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是一种缺乏雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2的特殊亚型乳腺癌。TNBC侵袭性强，转移率高，预后较差[1]。目前，多西紫杉醇(docetaxel, DTX)作为TNBC主要的化疗药物广泛应用于临床治疗，但获得性耐药已经成为一大障碍[2]。

前期研究中，课题组利用噬菌体展示技术筛选得到一种多肽LPLTPLP(P7)，可靶向结合肿瘤细胞膜表面的热休克蛋白90(heat shock protein 90, HSP90)并诱导其降解[9]。HSP90与肿瘤细胞内众多关键性信号调控因子有关，通过多条途径使肿瘤细胞的抗凋亡能力增强[3- 6]。临床试验显示HSP90抑制剂联用常规化疗药物能显著提高治疗效果[7- 8]。

本研究将HSP90抑制剂多肽P7与化疗药物DTX联合应用，探讨两药联合诱导细胞凋亡的可能机制，为增强TNBC对DTX化疗敏感性提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

TNBC细胞系MDA-MB- 231(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。药物DTX(北京中硕医药科技发展有限公司)；多肽P7(吉尔生化公司合成)；单克隆抗体(Cell Signal Technology公司)；细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：根据前期实验结果，将细胞分为：1)DTX组：0～100 nmol/L 8个浓度梯度；2)P7组：0～100 μmol/L 8个浓度梯度；3)P7 10、20和40 μmol/L分别与DTX 0～100 nmol/L 8个浓度梯度联用；4)DTX(nmol/L)与P7(μmol/L)分别以固定比例2∶1、1∶1、1∶2、1∶4联用。

1.2.2 SRB法检测细胞活性：将MDA-MB- 231细胞接种于96孔板，孵育过夜后分组处理。加药后继续培养48 h，经SRB法处理，在波长570 nmol/L处检测吸光度A值。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡：使用流式细胞计量术检测多肽P7和化疗药物DTX单用或联用对TNBC细胞系MDA-MB- 231凋亡水平的影响。按照上述实验方法分组加药处理细胞，流式细胞计量术步骤见参考文献[10]。随后使用BD AccuriTM C6流式细胞仪上机检测凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 P7与DTX联合对MDA-MB- 231细胞增殖的影响

不同浓度药物处理MDA-MB- 231细胞48 h 后，DTX和P7均能抑制MDA-MB- 231(图1A, B)。在10、20 和40 μmol/L P7共处理的条件下，DTX的半数有效浓度IC50明显降低(图1C)。P7联合DTX的剂量比例均位于等效线下方(图1D)，表明P7和DTX具有协同作用。

此外，本研究还计算了联合作用指数(combined index, CI)，判断DTX与P7的协同性。计算公式为CI=DA/ICX,A+DB/ICX,B(A、B代表两种不同药物，ICX,A和ICX,B是两种药物单独使用使生长抑制率达X时的药物浓度，DA和DB是两药联用使生长抑制率达X时两种药物的浓度)。当CI>1、CI=1或CI<1时，两药分别为拮抗、叠加或协同作用。通过抑制率Fa- 合用指数CI曲线，结果显示CI<1，进一步表明P7和DTX有协同作用(图1E)。

2.2 P7与DTX联合促进细胞凋亡

合用后MDA-MB- 231细胞的凋亡率约为60.6%，是DTX单药组的1.8倍(图2A, B)。与对照组相比，DTX组(P<0.05)及两药联用组(P<0.01)细胞凋亡相关蛋白Bax与Bcl- 2表达量的比值Bax/Bcl- 2明显升高。与DTX单药组相比，两药联用组Bax/Bcl- 2明显降低(P<0.05)(图2C, D)。

A.cell viability in MDA-MB- 231 cells following 48 hours treatment of DTX; B.P7; C.DTX combined with P7; D.synergism of the interaction between DTX and P7 against MDA-MB- 231 cells according to the isobologram method; E.Fa-CI plot

A.following treatment with 0 (vehicle control), P7 20 μmol/L or DTX 10 nmol/L or P7 20 μmol/L combined with DTX 10 nmol/L for 48 hours, MDA-MB- 231 cells were subjected to Annexin V/PI staining and flow cytometry analysis to determine apoptotic cells; B.statistics of cell distribution in each group; C.effect of DTX and/or P7 on apoptosis-relevant proteins in MDA-MB- 231 cells as determined by Western blot; D.effect of DTX and/or P7 on Bax/Bcl- 2 ratio at protein level;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with DTX group

3 讨论

HSP90是一种新的肿瘤治疗靶点，HSP90抑制剂与紫杉醇类化疗药物联合具有良好的协同作用。17-AAG、AUY922以及Ganetespib 等HSP90抑制剂与紫杉醇类药物联用，可以提高非小细胞肺癌和前列腺癌等肿瘤的治疗效果[7- 8]。已经有研究证明，HSP90与紫杉醇类药物的作用靶点微管蛋白之间存在着联系。HSP90保护微管蛋白不变性并稳定微管蛋白的聚合[11]。同时，HSP90作为分子伴侣，其客户蛋白在调控细胞周期及凋亡中发挥着重要作用，诱导HSP90降解能通过多条途径激活细胞的凋亡通路，避免了信号通路之间的代偿。新型的HSP90抑制剂如BIIB021、NVP-AUY92229和Ganetespib等改进了化学结构，与二代HSP90抑制剂17-AAG和17-DMAG相比肝毒性明显降低。然而遗憾的是，新型HSP90抑制剂仍有一定的不良反应，如腹泻、转氨酶升高等。这些不良反应限制了其临床应用。

多肽具有高亲和力、高靶向特异性和高稳定性的特点，同时也显示出一系列小分子药物所具有的特点，例如快速的组织渗透性，较低的免疫应答激活风险。基于多肽类药物与靶点特异性高的强结合作用，多肽类药物可以使用较低的给药剂量，避免出现主要的不良反应。前期研究筛选出了多肽P7，使用类免疫共沉淀及质谱分析技术鉴定了多肽P7的结合位点为HSP90。多肽P7可特异性结合肿瘤细胞表面的HSP90并诱导其降解，为HSP90抑制剂[9]。本研究中HSP90靶向抑制剂双功能多肽P7与化疗药物多西紫杉醇联用表现出良好的协同作用，也为将多肽作为载体、合成P7与DTX偶联靶向药提供了研究基础。

DTX使有丝分裂阻滞，导致细胞凋亡。HSP90的许多客户蛋白在凋亡调控中发挥着重要作用[12]。前期研究证明，HSP90抑制剂多肽P7可诱导HSP90降解，激活细胞凋亡通路，提高细胞凋亡率[9]。Bcl- 2和Bax是重要的凋亡相关蛋白，抑凋亡蛋白Bcl- 2与促凋亡蛋白Bax的表达水平决定了细胞的存活或凋亡。上调Bax/Bcl- 2比值对诱导肿瘤细胞凋亡，提高化疗敏感性有重要作用。本研究将HSP90抑制剂多肽P7与化疗药物DTX联合应用，结果显示P7协同DTX诱导TNBC细胞MDA-MB- 231凋亡，凋亡相关蛋白Bcl- 2、Bax表达量比值显著降低。

综上所述，P7能协同增强DTX对人TNBC细胞MDA-MB- 231的杀伤作用，其机制与调控凋亡相关蛋白的表达有关，这为提高TNBC细胞对DTX的敏感性提供了新的研究思路。

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