食管癌患者外周血中miR-181b-5p表达水平下降

古丽尼格尔·雪合拉提，王延蛟，祖力皮喀尔·阿卜杜热合曼，娜孜拉木·玉苏甫江，斯坎德尔·白克力

(新疆医科大学 基础医学院 生物化学与分子生物学教研室，新疆 乌鲁木齐 830011)

中国是食管癌发病率和病死率较高的地区[1]，全国发病率占第6位，病死率占第4位。与此同时，食管癌也是新疆地区人群中最常见的恶性肿瘤，病死率达 155.9/10 万[2]。然而，当患者确诊时，病程往往已经发展为进行性吞咽困难并出现恶病质症状，5年生存率低于15%[2]。因此，寻找食管癌特异性较强、灵敏度高的血清标志物，提高其早期诊断率并改善患者预后是目前食管癌领域中迫切需要解决的问题。

microRNAs(miRNAs)通过促进或抑制来调节靶基因的表达， 其表达水平发生紊乱是诱发一系列肿瘤形成的重要因素，同时miRNAs也可作为肿瘤标志物用于食管癌、肝癌等恶性肿瘤的诊断和预后评估，并有望在食管癌的早期诊断方面取得进展，成为食管癌治疗靶点[3]。

本实验通过miRNA芯片分析筛选患者外周血单一miRNA候选指标，并用RT-qPCR法进行检测和比较，探讨其对食管癌的诊断和预后评估的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料：收集2013年4月至2013年12月在新疆医科大学第一附属医院就诊或住院治疗的36例食管癌患者，其中男24例，女12例，平均年龄64；并选取26名健康志愿者。所有食管癌患者均符合食管癌的临床诊断标准，并经病理学检查确诊。患者一般资料之间相比无差异，具有可比性，设置健康志愿者为对照组。食管癌组患者均经病理学检查确诊并符合诊断标准，入选对象年龄范围48～71岁，性别和民族不限；患者无其他位置肿瘤；实验前未经放化疗以及相关抗肿瘤药物治疗；所有患者无心血管疾病以及肾功能不全；所有患者平素身体状况较好，无感染性疾病及血液系统疾病；食管癌患者和健康志愿者均同意实验措施，并签署知情同意书。不符以上条件患者均排除实验对象。此研究经伦理委员会批准。

1.1.2 试剂：miRNAs反转录试剂盒(Qiagen公司)；荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa公司);引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

内参U6引物序列：上游引物：5′-GCTTCGGCA CATATA-3′；下游引物：5′-CGAATTTGCGTGTCATC CTT-3′；miR-181b-5p引物序列：上游引物：5′-AA CACGCAACATTCATTGCTG-3′；下游引物：5′-GTCG TATCCAGTGCAGGGT-3′。

1.2 方法

委托北京博奥生物有限公司对白细胞总RNA的miRNA芯片筛查分析，并筛选差异表达候选单一miRNA，RT-qPCR法进行检测比较。收集全血样本3 mL，静置，3 000 r/min离心10 min。Trizol法提取外周血白细胞总RNA，按照试剂盒说明反转录合成cDNA，并进行RT-qPCR实验，结果以2-ΔΔCt法进行计算。

1.3 统计学分析

2 结果

食管癌组患者外周血白细胞miR-181b-5p表达水平明显低于正常对照组(P<0.01)(图 1)。

*P<0.01 compared with control图1 正常对照组与癌组的miR-181b-5p表达水平Fig 1 Expression of miR-181b-5p in control group

miR-181-a和内参基因U6的RT-qPCR实验结果(图2)，均出现特异的单峰，曲线整齐可信。

3 讨论

食管癌是恶性肿瘤之一，具有早期诊断难、预后差等特点。中国是食管癌的高发国家，食管癌目前的诊断率仍然很低，且对食管癌的治疗方法仍以手术为主，患者术后的 5年总生存率仅为 15%[4]。近年来，肿瘤标志物在肿瘤的早发现、肿瘤的筛查、肿瘤的诊断及鉴别诊断、肿瘤的分期、肿瘤的检测和预后判断等方面发挥着重要作用。miRNA的异常表达可能与多种肿瘤的发生发展有关[5]，研究肿瘤患者外周血液中特异性miRNAs，既可以探索其在肿瘤发病机理中的作用，也可以用于肿瘤早期诊断的血清标志物的筛查，实现肿瘤的“早发现，早治疗”。miRNAs广泛存在于生物体内，是一类内源性非编码的单链小分子 RNA，在调节细胞功能，在个体发育、细胞凋亡、代谢以及疾病的发生方面发挥着重要的作用[8]。miRNAs表达异常的现象普遍存在于多种肿瘤中，已经有研究报道，miRNAs通过调控多种信号通路直接或间接参与肿瘤的发生与发展。

A.dissociation curre 1; B.amplification curre; C.dissociation curre 2图2 U6与miR-181b-5p的熔解曲线和扩增曲线Fig 2 Dissociation curve，amplification curve of U6 and miR-181b-5p

本研究通过miRNA芯片分析筛选食管癌患者外周血差异表达的miR-181b,探讨其在食管癌中的诊断和预后中的意义。miR 181家族有4个成员：miR-181(a、b、c、d)。经数据库(miRNA.org)分析预测，它们有相同的靶基因：INPP4B和PHLPP2。INPP4B基因通过抑制PI3K/AKT信号传导通路，从而调控细胞增殖和血管生成等过程，是一种新发现的潜在肿瘤抑制因子。INPP4B基因在胃癌患者外周血[6]、前列腺癌[7]、结肠癌及乳腺癌[8]中的表达水平均下调，但在食管癌中的研究不多。PHLPP2是[9]新发现的抑癌基因，其主要功能抑制AKT通路，促进细胞凋亡和抑制细胞增殖，它的异常表达与卵巢癌[10]和肺癌[11]相关。

本研究结果显示，食管癌患者外周血中miR-181b-5p的表达水平明显低于健康志愿者，与报道[12]中通过表达上调抑制细胞增殖的结果相一致。推测miR-181b-5p在食管癌中可能有新的作用靶点，也可能在食管癌中的低表达是促癌作用的表现。因此，miR-181b-5p可否有望成为食管癌患者新的特异性诊断指标或预后评估指标，甚至是有效的临床治疗靶点，尚待进一步深入研究。

参考文献：

[1] 王立东,胡守佳,吕双,等.食管癌基础研究进展及临床应用前景[J].河南医学研究，2016, 25:1345-1347.

[2] Lin Y, Totsuka Y, He Y,etal. Epidemiology of esophageal cancer in Japan and China[J]. J epidemiol, 2013, 23: 233.

[3] Napier KJ, Scheerer M, Misra S. Esophageal cancer: A Review of epidemiology, pathogenesis, staging workup and treatment modalities[J]. World J Gastrointest Oncol, 2014, 6:112-120.

[4] Zhao BS, Liu SG, Wang TY,etal. Screening of microRNA in patients with esophageal cancer at same tumor node metastasis stage with different prognoses [J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14: 139-143

[5] 许宇彪, 杨建荣. microRNA在人类恶性肿瘤中的研究进展[J].中国临床新医学, 2016, 9: 833-837.

[6] Yang M, Wang HB, Hu QL. significance of the expres-sion of INPP4B mRNA and protein in peripheral blood of gastric cancer patient[J].Modern Oncol,2016,24：3443-3446.

[7] Murillo H, Huang H, Schmidt LJ,etal．Role of P13K signaling in survival and progression of LNCaP prostate cancer cells to the androgen refractory state [J]. Endocrinology, 2001, 142: 4795-4805.

[8] Croft A, Gou ST,Shervin S,etal. Functional identification of a novel transcript variant of INPP4B in human colon and breast cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,485: 47-53.

[9] Gao T, urnari F, ewton AC,etal. PHLPP: A phosphantase that directly dephosphorylates AKT, promotes apoptosis, and suppresses tumor growth[J]. Mol Cell,2005, 18:13-24.

[10] Liao Y, Deng Y,Liu J,etal. MiR-760 overexpression promotes proliferation in ovarian cancer by downregulation of PHLPP2 expression[J]. Gynecol Oncol, 2016,143: 655-663.

[11] Mei Z,He Y,Feng J,etal. MicroRNA-141 promotes the proliferation of non-small cell lung cancer cells by regulating expression of PHLPP1 and PHLPP2[J]. FEBS Lett, 2014,588: 3055 -3061.

[12] Zhi F, Wang Q, Deng D,etal. miR-181b-5p down regulates NOVA1 to suppress proliferation, migration and invasion and promote apoptosis in astrocytoma[J]. PLoS One, 2014, 9:1-9.