长期单纯高尿酸血症大鼠主动脉病理变化

刘淑芬，王 琦，马 亚，曾学军

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 物理医学康复科, 北京 100730；2.南京医科大学第一附属医院 风湿免疫科, 江苏 南京 210029； 3.首都儿科研究所附属儿童医院 超声科, 北京 100020;4.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 普通内科, 北京 100730)

近年来，国内外大样本临床流行病学研究发现，高尿酸血症(hyperuricemia，HU)可以增加人体发生心血管疾病的风险[1- 2]，这些结果越来越被临床关注， 甚至有专家提出应该开始对合并心脑血管危险因素的HU患者进行治疗[3]。迄今，基础研究对于HU升高心血管疾病发病风险的机制研究甚少，HU是否能够引起或加速动脉粥样硬化尚无确证研究。本研究建立长期HU大鼠模型,来观察单纯HU12周能否引起大鼠主动脉动脉粥样硬化病理变化，并对HU的致病机制进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：SPF级SD雄性大鼠16只，体质量200～250 g[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证：SCXK(京)2016- 0006]。所有动物实验经过单位伦理委员会批准，对动物处置方法符合动物伦理学要求。

实验试剂：氧嗪酸钾(济南中科一通化工有限公司)；尿酸(Sigma Aldrich公司)；氧嗪酸钾大鼠饲料(每10 kg饲料内加入200 g氧嗪酸钾,北京科奥协利饲料有限公司)；普通大鼠饲料(北京科奥协利饲料有限公司)；尿酸饮水(尿酸用灭菌动物饮用水配成 100 μmol/L溶液)自配；氧嗪酸钾灌胃液(氧嗪酸钾用灭菌动物饮用水配成 100 mg/mL混悬液)自配。

1.2 方法

大鼠分组及处理：大鼠适应性饲养1周，采集基础数据后，将大鼠随机分成空白对照组及HU组，空白对照组给予普通饲料、水饲养，HU组给予氧嗪酸钾饲料+尿酸饮水饲养，给药第7、14、21、28、35、49、63、77和84天下午将大鼠禁食12～14 h，次晨称质量，乙醚麻醉后经内眦采血,监测血尿酸水平，维持造模组血尿酸持续显著高于空白对照组。

标本获取：实验开始后第84天(12周末)， 经腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，经腹主动脉取血后处死大鼠，向上剪开胸腔，在胸腔内找到心脏和胸腹主动脉，剔除周围脂肪组织及疏松结缔组织，将胸腹主动脉剪下，0.9%的氯化钠溶液清洗一下腔内血块，剪去1段腹主动脉放入已标号的含甲醛溶液的小瓶内固定。

HE染色：大鼠主动脉标本的经固定、包埋和切片，HE染色，光镜下测定主动脉内膜-中膜厚度变化、内膜炎性细胞浸润及内膜表层脂纹脂斑形成情况。

免疫组化：大鼠主动脉标本的经固定、包埋和切片，免疫组织化学法测定eNOS、ET- 1、ICAM的表达，用着色细胞平均吸光度值指标进行分析，所有病理图像均使用计算机显微图像分析系统(image-pro plus6.0)。

ELISA和酶法：大鼠内眦取血后，立即离心取血清，保存于-25 ℃冰箱中，使用全自动生化分析仪Olmpus AU 5400，进行血尿酸检测，使用ELISA进行ET- 1和ICAM的检查，使用酶法进行血清NO的检测。

1.3 统计学分析

2 结果2.1 动物一般资料

第14天时，HU组血清尿酸(UA)浓度(239±38)μmol/L较对照组(189±29)μmol/L显著升高(P<0.05)；之后，HU组大鼠血清尿酸浓度均较对照组显著升高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with control group图1 两组大鼠各时间点血清尿酸浓度Fig 1 Serum UA at different days

2.2 主动脉病理改变

2.2.1 主动脉形态学变化

2.2.1.1 内膜-中膜厚度变化：正常对照组动脉壁内膜表面完整光滑无损伤，中膜平滑肌排列整齐，厚薄均匀。HU组部分大鼠可见动脉壁内皮细胞水肿和脱落(2/8)，中膜平滑肌细胞排列紊乱(2/8)，部分平滑肌有细胞水肿和增殖，内膜灶性增厚(2/8)。内膜-中膜厚度轻度增加(图2)。

2.2.1.2 内膜炎性细胞浸润：正常对照组内膜表面光滑完整无损伤，内皮细胞排列紧密无脱落，少见单核细胞、巨噬细胞等炎性细胞黏附和浸润(图2A)。HU组部分大鼠可见内皮细胞肿胀，部分脱落；1只大鼠内膜出现大量单核细胞、巨噬细胞和泡沫细胞聚集(图2B)。

A.arota in control group(×200)；B.arota in HU group(×200)； C.arota in control group(×400)；D.arota in HU group(×400)

图2大鼠主动脉HE染色
Fig2RatarotaHEstaining

2.2.1.3 内膜脂斑形成情况：HU组1只动物动脉内膜出现小脂斑，表现为泡沫细胞聚集，周边可找到单核巨噬细胞，但病灶内未找到变性的胶原纤维(图2B)。

2.2.2 主动脉eNOS、ET- 1、ICAM蛋白表达变化

2.2.2.1 主动脉eNOS表达：高倍镜下阳性细胞的细胞浆染成黄褐色提示有eNOS表达，HU组主动脉内膜黄染的eNOS表达较对照组明显减少(216±33vs308±42，P<0.05)(图3)。

A.arota in control group(×400)； B.arota in HU group(×400)图3 大鼠主动脉eNOS染色Fig 3 Rat arota eNOS staining

2.3.2.2 主动脉ET- 1表达：高倍镜下阳性细胞的细胞膜和细胞浆染成黄褐色提示有ET- 1表达。HU组主动脉内膜的ET- 1表达显著高于对照组(423±45vs278±31，P<0.05)(图4)。

2.2.2.3 主动脉ICAM表达：高倍镜下阳性细胞的细胞膜和细胞浆染成黄褐色提示有ICAM表达。与正常对照组比较，HU组主动脉内膜的ICAM表达明显增强(356±28vs210±23，P<0.05)(图5)。

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)图4 大鼠主动脉ET- 1染色Fig 4 Rat arota ET- 1 staining

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)图5 大鼠主动脉ICAM染色 Fig 5 Rat arota ICAM staining

2.3 血清ET- 1、ICAM、NO浓度

实验结束时D84，HU组大鼠血清ET- 1和ICAM均较对照组显著升高;而 NO较对照组显著降低(表1)。

表1 两组大鼠血清ET- 1、ICAM、NO浓度

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

3 讨论

本研究通过长期氧嗪酸钾饲料以及尿酸水喂养与氧嗪酸灌胃合并的方法，建立了长期高尿酸血症(hyperuricemia，HU)大鼠模型，发现造模12周后HU组大鼠可见动脉壁内皮细胞水肿、脱落，内膜灶性增厚，中膜平滑肌细胞排列紊乱，内膜-中膜厚度轻度增加，浸润于内膜的炎性细胞数轻度增多；免疫组化显示HU组主动脉内膜eNOS表达较对照组显著减少， ET- 1和ICAM表达较对照组明显增多，且HU组血清NO较对照组显著降低，ET- 1和ICAM较对照组显著升高。

在高血脂、高血糖与动脉粥样硬化的关系的早期研究中，通过高脂、高糖动物模型的建立，观察高血脂、高血糖对动脉的直接影响，为其致病机制提供了重要信息[4- 7]。但既往直接观察单纯高尿酸血症对主动脉的结构影响的研究很少，可能原因推测如下：短期高尿酸血症对主动脉不可能产生明显的变化，而长期高尿酸血症动脉模型造模非常困难[8]。本研究建立的HU模型发现，其主动脉的变化与早早期(糖尿病模型8周)时有些类似变化。

2015年，一项选用新西兰白兔进行的动物实验，也发现了跟本研究类似的现象，看到了HU组内膜的增厚，也未看到典型的动脉粥样硬化斑块[9]。其与本研究的不同之处在于内膜厚度变化更显著。分析该研究与本研究产生差异的原因如下:1)选用的实验动物不同，该研究选用的动物为新西兰白兔，本研究选用的动物为S-D大鼠，大鼠的体内脂质代谢过程与人类存在较大差距，可能不利于观察到典型动脉粥样硬化表现[10- 11]。2)样本量有所差异：该研究的每组动物为12只，而本研究仅为8只。

综上所述，长期单纯高尿酸血症(12周)本身，尚不足以引起大鼠主动脉典型的动脉粥样硬化，但其能够引起主动脉的eNOS表达下降，ET- 1、ICAM表达增加。

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