槲皮素促进小鼠脊髓损伤后巨噬细胞表型转变及功能恢复

卢桃利，霍芳芳，翟中杰，张 蓓

(1.成都市第二人民医院 神经内科，四川 成都 610015；2.空军军医大学第一附属医院 神经内科，陕西 西安 710003；3.空军军医大学 卫生统计学教研室，陕西 西安 710003)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后炎性反应在神经修复中的作用一直备受争议。而研究报道，中枢神经系统损伤后损伤局部的巨噬/小胶质细胞被激活为两种不同的表型：促炎表型即经典激活型(classically activated-M1)和抑炎表型(M2)即选择激活表型(alternatively activated)。M1表型可以释放大量促炎因子，具有神经毒性作用；而M2表型可以促进轴突生长及组织修复。因此促进损伤局部的M1表型巨噬/小胶质细胞向M2转变有利于神经损伤修复[1- 2]。

槲皮素(3,3,4,5,7-五羟基黄酮)属黄酮类化合物，可以降低由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)刺激引起的小鼠小胶质瘤细胞(BV2细胞)中诱导性一氧化碳合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达，下调细胞外信号调控激酶c-Jun、AKT、SRC、JAK-1及AP- 1的表达水平，具有较强的抗炎抗氧化作用[3- 4]。但其对巨噬/小胶质细胞表型的影响尚不明确，本研究采用脊髓钳夹法建立小鼠脊髓损伤模型，探讨槲皮素对损伤局部炎性微环境尤其是巨噬/小胶质细胞表型的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 SPF级动物：8周龄雌性C57BL/6小鼠，体质量15～20 g。空军军医大学实验动物中心[动物合格证号SCXK(军)2012- 0007]。

1.1.2 试剂：槲皮素(Sigma公司)；anti-arginase1、anti-iNOS及anti-CD11b抗体(Abcam公司)；驴抗兔488、驴抗羊555和驴抗大鼠594荧光二抗(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：将小鼠分为脊髓损伤组暴露 T9-T11 节段椎板，咬除 T10 节段椎板后分离硬脊膜，将力量为 50 g的动脉夹置于T10两侧并持续 30 s，如此可有效破坏小鼠皮质脊髓束，缝合肌肉层和皮肤。槲皮素治疗组于术后给予槲皮素(50 mg/kg)，每12 h给药1次。术后定时压迫膀胱协助其排尿。

1.2.2 免疫荧光染色分析M1和M2细胞:对损伤脊髓节段OCT包埋后，行矢状位连续冰冻切片(n=3/组)，经0.3% Triton破膜及5% BSA封闭处理后，一抗孵育：Goat anti-Arginase-1(1∶100; M2 Marker)和Rat anti-iNOS(1∶100; M1 Marker)， 分别与Rabbit anti-CD11b(1∶200; 巨噬/小胶质细胞Marker)进行双标， 4 ℃冰箱过夜。PBS漂洗后，行Alex-flour 标记：驴抗兔488、驴抗羊 555 和驴抗大鼠 594 荧光二抗(1∶1 000)室温避光孵育2 h，PBS漂洗晾干后DAPI封片，即可进行激光共聚焦荧光显微镜观察和拍摄。通过计算iNOS+细胞数与CD11b+细胞数比例(iNOS/CD11b)代表损伤局部M1表型细胞的比例，同时，计算Arg1+细胞数与CD11b+细胞数比例代表M2表型细胞的比例。

1.2.3 Real-time PCR检测炎性因子 mRNA 的表达:取损伤中心至头侧和尾侧各 1.5 mm，进而通过Trizol法提取损伤节段总 RNA，检测浓度后上游引物转录为cDNA后即可进行real-time PCR反应。引物设计合成: NOS2:上游引物:5′-TTTTGTTGTT CATCTCGGA-3′,下游引物: 5′-CAGGCAGTATCACT CATTG-3′; TNF-α：上游引物：5′-ACTTGGTGGTTTG CTACGAC-3′,下游引物:5′-CTTCCAGAACTCCAGG CGGT-3′; TGF-β:上游引物:5′-CGTAGATAACGAA CAGGA-3′,下游引物:5′-CAAAGCAGGAGACCAGG A-3′; IL- 10：上游引物:5′-CTTATTTTCACAGGGGAG-3′,下游引物: 5-AGGGTTACTTGGGTTGCC-3; GAPDH:上游引物:5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT-3′, 下游引物：5′-GTGGAAGTTGCTGT-3′。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s，40个循环；95 ℃ 15 s后4 ℃保存。

1.2.4 行为学检测:根据 BMS(Basso mouse scale)量表对术后小鼠的运动功能进行评分。在损伤后1、3、7和14 d通过多个观察者对每只实验小鼠进行双盲法评分。主要从关节活动、后肢承重、步态等方面进行评估。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 损伤局部巨噬细胞表型变化

SCI后损伤局部巨噬细胞M1(iNOS/CD11b)表型比例随损伤时间逐渐增加，而M2(Arg1/CD11b)表型比例呈递减趋势，至损伤后期以M1表型为主(图1，2)。槲皮素治疗后能显著降低M1表型细胞的比例(P<0.01)，同时提高了M2表型的比例(P<0.01)。对两组损伤后各时间点的比较显示，槲皮素治疗组在损伤后3、7和14 d的M1表型比例均显著低于SCI组(P<0.05)，同时M2表型比例均显著高于SCI组(P<0.05)(表1，2)。

2.2 损伤局部炎性因子mRNA表达变化

槲皮素可以显著降低促炎因子(TNF-α和NOS2)mRNA的表达(P<0.05)(表3)；同时明显提高抑炎因子(TGF-β和IL- 10)mRNA的表达(P<0.05)(表4)。

表1 损伤节段各时间点M1表型巨噬细胞比例(iNOS/CD11b)

*P<0.01 compared with SCI group.

表2 损伤节段各时间点M2表型巨噬细胞比例(Arg1/CD11b)

*P<0.05,**P<0.01 compared with SCI group.

2.3 神经功能损伤修复检测

各组小鼠整体上处理效应(P<0.01)和时间效应(P<0.001)，处理因素与时间因素存在交互作用(P<0.001)，槲皮素治疗组在损伤后7和14 d后BMS评分均显著高于SCI组(P<0.05)(表5)。

表3 损伤局部促炎因子TNF-α和NOS2 mRNA表达水平Table 3 mRNA expression of pro-inflammatory factors TNF-α and NOS2 in lesion n=3)

*P<0.05,**P<0.01 compared with SCI group.

表4 损伤局部抑炎因子TGF-β和IL- 10 mRNA表达水平Table 4 mRNA expression of anti-inflammatory factors TGF-β and IL- 10 in lesion n=3)

*P<0.05，**P<0.01 compared with SCI group.

图1 脊髓损伤后第7天SCI组和槲皮素治疗组损伤节段免疫荧光染色

图2 脊髓损伤后第7天SCI组和槲皮素治疗组损伤节段免疫荧光染色

group1day3days7days14daysSCI1.30±0.821.70±0.62 3.11±1.20 3.73±1.25quercetin1.00±0.811.90±0.88 4.62±1.43* 7.17±1.45**

*P<0.05，**P<0.01 compared with SCI group.

3 讨论

脊髓损伤后的局部炎性反应像一把双刃剑备受争议。一方面损伤局部的炎性细胞快速吞噬清理坏死组织，有助于轴突再生及功能修复；而过度激活的炎性反应又加重轴突的回缩、脱髓鞘及神经元凋亡[5- 6]。巨噬/小胶质细胞是损伤局部炎性反应的主要参与者。根据损伤微环境的不同，巨噬/小胶质细胞可以被迅速激活为M1或M2两种表型。其中LPS和IFN-γ可以促进巨噬细胞向M1表型转变，此种表型具有较强的抗原提呈作用，能产生大量促炎因子，如TNF-α、IL- 1b、IL- 6、IL- 12、IL- 23、NO和ROS等，对细胞内的病原微生物具有较强的杀伤作用。而IL- 4和IL- 13可以激活巨噬细胞向M2表型转变，进而产生IL- 4、IL- 5和IL- 10等大量抑炎因子，促进组织修复[7- 10]。

槲皮素是一种黄酮类的抗炎、抗氧化剂，能有效抑制iNOS的活性，促进Nrf- 2信号通路的激活[11]。本实验结果显示，脊髓损伤后第3天，损伤局部M1表型细胞与M2表型细胞比值(M1/M2)大体一致，而损伤7 d后， M2表型阳性细胞明显减少，致M1/M2比值迅速增加；而腹腔注射槲皮素，可以显著增加损伤局部M2表型细胞的比例，同时明显改善损伤局部炎性反应微环境，包括降低促炎因子IL- 1b、IL- 6和iNOS的表达及提高抑炎因子IL- 4和IL- 10 的表达。表明槲皮素对巨噬细胞表型的调控可能是其发挥抗炎作用的重要机制之一。

本实验还发现槲皮素可以促进脊髓损伤小鼠运动功能修复，而这可能与巨噬细胞表型由M1向M2转变有关。通过向SCI小鼠损伤局部注射脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)后发现，BDNF可以促进巨噬/小胶质细胞由M1向M2表型转变，并促进了运动功能恢复[12]。而向SCI小鼠移植间充质干细胞后，改善了损伤局部炎性反应微环境，并促进巨噬细胞表型向M2转变，同时促进了轴突再生及运动功能恢复[13]。但需要注意的是，槲皮素可以通过激活NA+-K+-2Cl-转运蛋白1(NKCC1)而增加胞质内Cl-浓度，进而刺激微管蛋白的聚合，促进神经突触的生长[14]。由此可见，槲皮素可以通过多重机制促进损伤后的神经修复。

综上所述，本研究表明腹腔注射槲皮素可以促进损伤局部巨噬/小胶质细胞表型由M1向M2转变，同时改善损伤局部炎性反应微环境及运动功能修复，但具体分子机制仍需进一步探讨研究。

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