TMEM38B纯合突变导致罕见ⅪⅤ型成骨不全症

吕 芳，徐晓杰，高 鹏，宋玉文，夏维波，邢小平，李 梅*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1.内分泌科 卫生部内分泌重点实验室；2.骨科， 北京 100730)

成骨不全症(osteogenesis imperfecta，OI)是一组临床表型和基因型具有明显异质性的罕见结缔组织病，其发病率为1/10 000～20 000，主要临床表型包括骨骼脆性增高、反复骨折和骨骼畸形，骨骼外表现包括蓝巩膜、牙本质发育不全和听力异常等[1]。

目前已发现至少19种致病基因(http://www.le.ac.uk/ge/collagen/)，其中85%～90%由 Ⅰ型胶原编码基因COL1A1和COL1A2突变所致，呈常染色体显性遗传，其他基因突变通过影响Ⅰ型胶原合成、翻译后修饰、折叠、胶原交联、骨骼矿化或成骨细胞分化，导致OI[1]。

1 材料与方法

1.1 对象

患者，男，2岁9月，维吾尔族人，因“反复骨折1年9月”，于2016年就诊于北京协和医院内分泌科。患者为第1胎第1产，母亲孕期平顺，足月顺产，出生体重2.7 kg，身长不详。患者1岁学习走路时出现右胫骨骨折，此后轻微外力下再骨折3次，分别为左胫骨和双股骨骨折，均行外固定治疗。既往史无殊。家族史：父母为近亲婚配(图1)，体健，否认骨折家族史。查体：身高83 cm(小于同性别和同年龄儿童-3SD)，体质量12 kg(位于同性别和同年龄儿童-1SD到中位数)，未见牙本质发育不全，巩膜稍蓝，粗侧听力正常。双下肢呈膝内翻畸形，四肢关节韧带无松弛。无脊柱侧突和后突畸形，胸廓无畸形。

本研究获北京协和医院科研伦理委员会批准，在研究开始前征得患者父母同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床表型评估：在北京协和医院检验科采用常规方法检测血清钙、磷、总碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶和肌酐；采用罗氏电化学发光法检测β-胶原降解产物、25羟维生素D和全段甲状旁腺素。在放射科完成头颅及胸腰椎侧位、双股骨和胫腓骨正位X线平片检查，采用双能X线吸收仪(DXA，GE Lunar公司)测定患者腰椎1- 4、股骨颈和全髋部位骨密度。

1.2.2 致病基因突变检测：采集患者及其父母外周静脉血，提取基因组DNA(采用QIAampDNA Blood Mini试剂盒)。采用二代高通量捕获测序平台(next generation sequence, NGS, Illumina HiSeq2000平台)检测OI致病基因，该平台覆盖19种已知成骨不全症的致病基因(包括COL1A1、COL1A2、IFITM5、PPIB、SERPINF1、CRTAP、SERPINH1、FKBP10、SP7、BMP1、TMEM38B、PLOD2、P3H1、P4HB、PPIB、SEC24D、SPARC、WNT1和CREB3L1)和700余种其他罕见骨病的候选基因。目标区域碱基覆盖度为98.95%，测序深度达200×。

图1 患者家系图Fig 1 Pedigree of the OI family

针对NGS平台发现的致病突变，采用Primer 3软件设计引物，采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增相应外显子及其与内含子交界区。上游引物序列：5′-CACCCACATTTAAAGTCCC T-3′，下游引物序列：5′-GTGATAGAATTATGGCTCC CT-3′。PCR扩增产物纯化后，用荧光自动测序仪(ABI3700)直接测序，结果与参考序列NM_018112.2比对，以确定患者基因突变位点及类型，进一步与人类基因突变数据库(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)和成骨不全症数据库(http://www.le. ac.uk/ge/collagen/)比对，确定其是否为新型突变位点。

2 结果

2.1 患者临床表型特点

患者幼年起病，主要表现为反复轻微外力下骨折，并逐渐出现双下肢骨骼畸形，巩膜稍蓝，无听力异常及牙本质发育不全等骨骼外表现。患者肝肾功能正常，血钙：2.48 mmol/L(参考范围：2.13～2.70 mmol/L)，磷：1.87 mmol/L(参考范围：1.29～1.94 mmol/L)，总碱性磷酸酶：180 U/L(参考范围：42～390 U/L)，甲状旁腺素：18.5 pg/mL(参考范围：12.0～65.0 pg/mL)，均在正常范围内。25羟维生素D：9.5 ng/mL (参考范围：20～50 ng/mL)，提示维生素D严重缺乏，骨吸收指标β-胶原降解产物浓度：1.55 ng/mL(参考范围：0.26～0.512 ng/mL)，高于正常。骨骼X线片示胸腰椎骨质疏松，双股骨、胫骨弯曲畸形，双股骨和右侧胫骨骨皮质不连续，局部骨痂形成，颅骨未见明显缝间骨(图2)。骨密度：腰椎1-4为0.292 g/cm2(Z评分为-4.97)，股骨颈为0.207 g/cm2(Z评分为-7.55)，全髋为0.275 g/cm2(Z评分为-5.21)。因患者骨折未愈合，仅给予钙剂和维生素D制剂治疗，暂未予双膦酸盐治疗。

2.2 OI致病基因突变分析

NGS采用SOAP aligner 软件对原始数据进行分析，比对多个正常人群单核苷酸多态性数据库，如单核苷酸多态性数据库(dbSNP build 137)，千人基因组计划数据库(the 1 000 Genomes Project)和华大公司内部数据库，以常染色体显性遗传<1%，常染色体隐性遗传<0.5%为阈值，鉴别单核苷酸多态性。进一步分析可能导致蛋白质异常的突变，包括框移突变、无义突变、错义突变和剪切位点突变等。发现患者存在TMEM38B纯合突变：第4外显子507位核苷酸G突变为A(c.507G>A)。Sanger测序证实上述结果。该突变导致169位色氨酸提前终止，产生截短蛋白(p.W169X)，其父母亲均为携带者(图3)。该突变在国内外OI患者中均有致病性报道[2- 4](表1)。

由于DEDS固有的离散性和内部机制的复杂性，往往难以用常规的差分方程、微分方程等数学模型来描述，同时关于系统动态过程的解析表达也很难得到，而离散事件系统仿真则能借助仿真的方式很好地描述DEDS各方面的性能，因此，它是目前研究DEDS最为流行的方法之一。

A.lateral films of the skull: no wormian bones at the occipital region; B.lateral films of the spine: osteoporosis without vertebral compression fractures; C.anteroposterior films of the femur and tibiofibular: bilateral bowing femurs and tibiofibular with fractures, slender long bone with thin cortices

图2成骨不全症患者的影像学表现
Fig2RadiologicalfindingsinpatientwithOI

A homozygous mutation ofTMEM38Bwas identified as: c.507G>A in exon 4.this parents were both asymptomatic heterozygous carriers for the mutation

图3TMEM38B测序结果
Fig3SangersequencingresultsoftheTMEM38B

3 讨论

本研究确诊一例以反复轻微外力下骨折为主要表现的OI儿童患者。患者存在低骨密度、长骨纤细且骨皮质菲薄的骨骼特点。生化检查提示维生素D缺乏、骨吸收指标升高。NGS发现TMEM38B第4外显子具有纯合突变(c.507G>A，p.W169X)。

TMEM38B于2012年首次被报道导致OI ⅪⅤ型，该基因位于9q31.2，编码跨膜蛋白38B[5]。跨膜蛋白38B为B型三聚物的细胞内阳离子通道(trimeric intracellular cation channel type B，TRIC-B)，在大多数组织的内质网表达，对维持内质网钙离子释放和储存有重要作用[4，6- 7]。钙离子参与I型胶原的合成、折叠、修饰和分泌等多个环节[4]，Ca2+依赖的激酶/磷酸酶信号通路参与多能间充质干细胞向成骨细胞分化[8- 9]。因此，TMEM38B突变可影响上述多个环节，导致骨骼脆性增加，反复骨折。

目前已报道5种TMEM38B突变导致OI(图4)，本研究首次在维吾尔族患者中发现TMEM38Bc.507G>A突变导致ⅪⅤ型OI (表1)。TMEM38B所致OI患者多为中重度临床表型OI，仅少数病情较轻，部分可有蓝灰色巩膜、听力异常和心脏瓣膜异常等骨骼外表现[2- 5, 9- 11]。本例与既往报道的TMEM38B突变患者临床表型类似。

OI临床诊断主要依赖于家族史、骨骼脆性增加和典型的骨骼外表现，影像学检查可以协助诊断，尚缺乏OI特异的生化指标。本例患者主要表现为反复骨折，无OI家族史，仅有巩膜稍蓝的骨骼外表现，因此诊断OI前需要进行鉴别诊断。现已有报道显示超过100种非创伤性疾病可导致骨骼脆性增加，如致密性成骨不全症、Hajdu-Cheney综合征、低磷骨软化、青少年特发性骨质疏松症、骨硬化症和先天性无痛症等[12]。大多数疾病通过临床表现、影像学检查和致病基因突变检测，能够很好地进行鉴别诊断。

OI尚无根治性治疗方法，双膦酸盐为最常用的治疗药物， 可通过抑制破骨细胞活性， 增加骨密度，减少骨折发生率。本中心曾报道三例TMEM38B突变患者接受双膦酸盐治疗，治疗后骨密度升高，骨折率下降[2]，但是双膦酸盐在OI ⅪⅤ型中的疗效尚需在大样本患者中进一步证实。

1-6.exon 1-6 of TMEM38B图4 已报道的TMEM38B的突变信息(A)和TRIC的分子模式图(B)Fig 4 Previous reported mutation information of TMEM38B(A) and topology model of TRIC channels(B)

familypatient(n)originsexsillencetypeage1stfracture(years)numberoffracturesdeformityBShearinglossDIBPstreatmentefficacyofBPsRef12ChineseHanMOIⅣ1.4-1.62-6nonononoyesBMD↑[2]2-46TurkishMOIⅣ0-20-13variablewhitetoblueNANAyesBMD↑,fracture↓[9]5NATurkeyNANANANANANANANANANA[3]61ChineseUygurMOIⅢ14yesyesnonononointhisresearch

BS.blue sclerae; DI.dentinogenesis imperfecta; BPs.bisphosphonates.

本研究确诊一例以反复轻微外力下骨折为主要表现的维吾尔族OI儿童患者，证实TMEM38B第4外显子纯合突变(c.507G>A，p.W169X)为其致病基因。对于幼年起病、反复骨折的患者，需重视OI的可能，应积极进行致病基因突变检测，有助于明确诊断及指导临床治疗。

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