干扰MITF表达对恶性黑素瘤细胞B16F10增殖及黑素生成的影响*

陈恒君，田超群，杨钰兴，袁睿（重庆市渝北区人民医院：.皮肤科；.泌尿外科400）

恶性黑素瘤是由皮肤、黏膜、眼等色素沉着部位的黑素细胞产生的一种高度恶性肿瘤，其特点为生长隐匿、转移早且迅速，患者预后差及病死率高，致死率达79.0%[1⁃3]。目前，已确定小眼畸形相关转录因子（MITF）在黑素细胞和黑素瘤细胞核中高表达[4⁃5]，是核蛋白最重要的转录因子，具有较强的诊断灵敏度和特异性[6⁃7]，但相关机制研究较少。本研究采用RNA干扰技术，研究了MITF对恶性黑素瘤的生长及黑素生成能力的影响，试图为恶性黑素瘤的治疗提供新的思路和策略，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 pLKO.1⁃短发夹RNA（shRNA）载体。

1.1.2 细胞系 B16F10黑素瘤细胞系购自KeyGen公司。细胞生长基质（培养液 1）为 RPMI⁃1640、10% 胎牛血清。细胞培养箱条件为37℃及5%二氧化碳。

1.1.3 主要试剂 RPMI⁃1640、10%胎牛血清均购自HyClone公司；mRNA提取试剂盒Trizol Reagent、逆转录试剂盒 PrimeScript™RT reagent Kit、扩增试剂盒SYBR Green RT⁃PCR Kit均购自 TaKaRa公司；蛋白抽提试剂盒、蛋白质印迹跑胶试剂盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、蛋白质印迹显影ECL化学发光试剂盒、Tri⁃ton⁃X100、MTT细胞活性检测试剂盒均购自Beyotime公司；蛋白定量试剂盒采用Pierce®BCA Protein Assay Kit，购自Thermo Scientific公司；免疫组织化学试剂盒购自博士德公司；MITF、β⁃actin蛋白抗体均购自Santa公司；DNA Marker、RNA Marker、LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；嘌呤霉素购自Sigma公司；MITF⁃shRNA质粒由KeyGen公司构建，并根据片段不同分别标注为 B16F10⁃NC（空白质粒对照）、B16F10⁃1、B16F10⁃2、B16F10⁃3，另建立未用任何质粒转染的阴性对照（B16F10组）。

1.2 方法

1.2.1 构建稳定干扰MITF表达的B16F10细胞系 将对数生长期B16F10细胞系传代并过夜（约24 h）培养，按标准流程，使用LipofectamineTM2000将扩增的shR⁃NA质粒中MITF沉默片段转染该细胞系。48 h后，使用添加嘌呤霉素（4µg/mL）的细胞培养液（培养液2）继续培养转染细胞系2周（每2～3天更换1次培养液2），将存活细胞单克隆移至96孔板中并使用培养液2继续培养，直至转染细胞系呈对数期生长并达90%以上的汇合率时将孔中细胞转移至培养瓶中使用培养液3（嘌呤霉素降至2µg/mL）继续培养并大规模传代以收集细胞系进行研究。每传代5～7次时再次使用培养液2进行筛选。

1.2.2 RNA提取及实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测MITF基因表达 按说明书使用Trizol Reagent提取总RNA，用分光光度仪（A260/280）测定总RNA，并按说明书使用PrimeScript™RT reagent Kit制备cDNA。MITF上游引物：5′⁃CGGGTCTCTGCTCTCCAGA⁃3′，下游引物：5′⁃CCGGCTGCTTGTTTTGGAA⁃3′。按下述方法配置 25µL 反应液：（1）SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）12.5 µL；（2）PCR 上游引物（10 µmol/L）1 µL；（3）PCR下游引物（10 µmol/L）1 µL；（4）DNA 模板 2 µL（＜100 ng，且液体量不超过反应液总体积的10%）；（5）dH2O 8.5µL。扩增反应条件：（1）预变性为 95℃、30 s，1次；（2）PCR 反应为 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 次；（3）溶解。1.2.3 蛋白提取及蛋白质印迹检测MITF蛋白表达 收集对数生长期细胞，在4℃条件下使用蛋白抽提试剂盒裂解细胞并收集蛋白；使用Pierce®BCA Protein Assay Kit按标准流程测定收集的总蛋白。根据测定结果按40µg的总蛋白量加样、检测、跑胶、转膜及显影。图像采集使用化学成像系统（ChemiDoc XRS+，Bio⁃Rad，USA）。图像分析采用Quantity One4.6软件。内参使用β⁃actin蛋白。

1.2.4 黑素含量测定 （1）细胞外分泌黑素含量测定：使用不含酚红的培养基在常规条件下培养细胞24 h并收集培养基（溶液1）；（2）细胞内分泌黑素含量测定：收集上述去除培养基的细胞，使用蛋白抽提试剂盒提取蛋白，离心500 r/min，上清液（溶液3）进行总蛋白测定，收集下层黑色固体物质与1 mol/L的NaOH溶液在60℃条件下孵育2 h并充分溶解（溶液2）。使用分光光度计在405 nm处测定黑素溶液1及溶液2中黑素含量。按每种细胞蛋白浓度标准化每种细胞内外黑素含量[8]。

1.2.5 酪氨酸酶（TYR）活性及 TYR/TYR⁃1/TYR⁃2蛋白检测 按下述方法配置溶液：（1）溶液A，配制含2%N，N⁃二甲基甲酰胺的磷酸钠（100 mmol/L，pH 7.1）；（2）溶液 B，配制含 5 mmol/LL⁃左旋多巴的磷酸钠（100 mmol/L，pH 7.1）；（3）溶液 C，配制含 20 mmol/L 的酚试剂去离子水。在细胞中加入0.5%Triton⁃X100（含1%脱氧胆酸钠）并孵育2 h裂解细胞，再按2∶1∶1比例加入溶液A、B、C，在37℃条件下反应10 min，然后在分光光度计下测定505 nm处吸光度。与1.2.4项相同，按每种细胞蛋白浓度标准化每种细胞的蛋白含量。

1.2.6 细胞增殖活性检测（克隆形成实验、MTT实验） 取对数生长期细胞并计数，按每孔500个细胞接种于96孔板中（每种细胞重复5个孔），加入培养基并在细胞培养箱中培养48 h，加入MTT溶液（5 mg/mL）10µL，继续在细胞培养箱中孵育4 h，再加入甲臜溶解液100µL后继续在细胞培养箱中孵育，直至结晶全部溶解，最后使用分光光度计测定570 nm处吸光度。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，组间和组内比较采用单因素方差分析（One⁃Way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MITF基因及蛋白表达水平比较 与B16F10组比较，B16F10⁃1组MITF基因干扰效率最大（达82.7%），B16F10⁃2、B16F10⁃3 组 MITF 基因干扰效率分别为 62.3%、21.5%；B16F10⁃1、B16F10⁃2、B16F10⁃3 组基因表达水平与B16F10组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。与 B16F10 组比较，B16F10⁃1 组MITF蛋白表达水平最低，干扰效率最高（50.0%），B16F10⁃2、B16F10⁃3 组蛋白表达干扰率分别为 22.1%、11.6%；B16F10⁃1 、B16F10⁃2、B16F10⁃3 组基因表达水平与B16F10组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），与MITF基因表达水平基本一致。见图2。表明B16F10⁃1为首选目标细胞系，其次为B16F10⁃2。

图1 各组MITF基因表达水平比较

2.2 各组增殖活性比较 与B16F10组比较，B16F10⁃NC组细胞增殖活性无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）；B16F10⁃1组细胞增殖活性降低最明显（达49.5%），B16F10⁃2组细胞增殖活性也有所降低（达23.8%）；B16F10⁃1、B16F10⁃2 组细胞增殖活性与 B16F10 组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.3 各组细胞内外黑素含量比较 B16F10⁃1组细胞内外黑素含量降低最明显（分别为49.7%、43.8%），B16F10⁃2组细胞内外黑素含量降低程度分别为21.4%、16.8%；B16F10⁃1、B16F10⁃2 组细胞内外黑素含量与B16F10组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），但B16F10⁃NC组细胞内外黑素含量均无明显改变，与B16F10组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与MITF基因和蛋白表达趋势一致，见图4。

图2 各组MITF蛋白表达水平比较

图3 各组增殖活性比较

图4 各组细胞内外黑素含量比较

2.4 各组TYR活性比较 与B16F10组比较，B16F10⁃1组TYR活性降低最明显（达48%），B16F10⁃2组TYR活性降低了 29.0%，B16F10⁃1、B16F10⁃2 组 TYR 活性与B16F10组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 各组TYR活性比较

3 讨 论

目前，已确定MITF选择性表达于黑素细胞和黑素瘤细胞核，是黑素细胞的核蛋白和最重要的转录因子，在黑素细胞生成和活性方面具有关键性作用。目前，已证实该基因在黑素细胞起源细胞（如黑素母细胞、黑素细胞及黑素瘤细胞）中参与了形态、分化和生存的调节[7，9]；而在黑素瘤患者中该基因处于失调状态[6]，是一种诊断黑素瘤灵敏度和特异性均较强的免疫标记物[7]。

MITF在黑素细胞中特异表达，是调节黑素细胞发育的关键转录因子和总调控因子，参与了黑素细胞形态构成、黑素合成、转运和运输。MITF主要通过调控黑素细胞中特异表达基因TYR的转录活性调节黑素分泌，TYR参与并调控黑素合成，是黑素生成的关键酶[10]。

本研究以MITF为靶基因，利用RNA干扰技术特异性抑制该基因及蛋白表达，观察B16F10黑素瘤细胞增殖活性变化，进而探讨MITF对黑素瘤细胞内外黑素分泌水平的影响及与该分泌水平密切相关的TYR活性的影响，从而验证MITF高表达在黑素瘤细胞中的关键作用。结果显示，RNA干扰技术能在B16F10细胞中显著抑制MITF基因及蛋白表达，最高干扰率分别达82.7%、50.0%；MTT实验结果显示，干扰MITF表达能显著抑制B16F10细胞增殖活性，表明MITF对黑素瘤细胞增殖活性具有重要作用。与VACHTENHEIM等[11]研究结果一致。本研究B16F10细胞内外黑素含量测定结果显示，干扰MITF表达能显著抑制黑素瘤细胞内外黑素分泌水平；TYR活性测定结果显示，干扰MITF表达也抑制了与黑素分泌水平密切相关的TYR的活性，表明MITF对黑素瘤细胞中的TYR活性及黑素生成均具有重要作用，与黑素瘤细胞中的黑素功能密切相关。

目前，较一致的看法是MITF在黑素细胞的黑素生成和活性方面均具有关键性作用。本研究结果不仅证明了MITF对黑素瘤细胞的增殖具有重要作用，更进一步证明了MITF在黑素瘤细胞黑素生成及活性调节方面发挥了关键性作用。为了更深入的研究，包括MITF如何调节黑素瘤细胞的增殖活性及黑素生成的活性，以及上、下游基因和相关信号通路等研究奠定了重要的实验基础，从而为恶性黑素瘤的治疗提供了新的思路和策略。

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