雌激素受体基因多态性与绝经后妇女腱鞘炎关系的研究*

黄爱军，汪曾荣△，陈丽萍，马树强，陈瑞云，陆学东，林昆，黄醒中，陈庠仑（.中山大学附属第八医院（深圳福田）骨科，广东深圳58033；.深圳市福田区第二人民医院肾内科，广东58049）

腱鞘炎是女性多发病，目前认为，主要发病原因是腱鞘因机械性摩擦而引起的慢性无菌性炎症改变，与长期慢性劳损、先天性肌腱异常、类风湿关节炎、内分泌紊乱等有关[1⁃2]。但哺乳期或更年期妇女发病率高于其他女性，这2类人群均伴雌激素水平的显著变化，是否说明雌激素在妇女腱鞘炎发病中可能起着重要的作用？雌激素通过与雌激素受体（ER）结合而发挥生物学效应，而ER基因具有多态性和变异性的特点，不同亚型的基因可能与不同的女性高发性疾病有关，如骨质疏松、类风湿关节炎等[3]。目前，国内外尚无有关ER基因多态性与女性腱鞘炎关联性的研究。因此，通过分析ER基因多态性与腱鞘炎的关系，进一步深化对女性腱鞘炎发病机制的探讨，具有重要的指导意义。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选取2012年8月至2015年12月中山大学附属第八医院门诊收治的绝经期女性111例，均为绝经1年以上。按患病情况分为A组（腱鞘炎患者）48例，年龄 46～71岁，平均（58.8±5.6）岁；平均绝经年限（8.75±4.97）年。B组（绝经期健康女性）63例，年龄52～72岁，平均（61.4±4.8）岁；平均绝经年限（11.35±5.78）年。另选取63例非绝经期健康女性（C组）作为健康对照组，年龄 22～47岁，平均（35.3±6.6）岁。本研究经医院伦理委员会审查通过，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 排除标准 （1）过早绝经（≤40岁）；（2）有卵巢切除术史；（3）有ER相关疾病史，如卵巢癌、乳腺癌、类风湿关节炎、骨质疏松等；（4）有肝、肾及内分泌疾病和自身免疫性疾病；（5）检测期间服用激素或避孕药，或选择性ER调节剂。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集所有研究对象早上8：00～9：00空腹状态下外周静脉血4 mL置于乙二胺四乙酸抗凝试管中，分离白细胞并采用酚/氯仿法提取基因组DNA（美国Promega公司提供试剂盒），纯化后−30℃低温保存。

1.2.2 引物设计

1.2.2.1 检测技术 采用聚合酶链反应（PCR）⁃限制性片段长度多态性技术。

1.2.2.2 引物 参照文献[4]设计引物，用于研究的ER⁃α基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切位点多态性引物系列由上海英骏生物工程技术服务有限公司（Invitrogen）合成，上游：5′⁃CTGCCACCCTATCTTTTCCTATTCTCC⁃3′，下游：5′⁃TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATATCTGA⁃3′。PCR主要试剂由立陶宛Fermentas公司提供；DNA片段长度标准（PCR Markers⁃Ⅲ）由北京天为时代科技有限公司提供；XbaⅠ和PvuⅡ限制性内切酶为美国Promega公司提供；

1.2.2.3 凝胶电泳 采用1%西班牙琼脂糖凝胶。

1.2.3 PCR反应 PCR扩增反应体系为25µL，其中基因组 DNA 0.1 µL，10 mmol/L Tris⁃HCl（pH=9.0），50 mmol/L KCl，1%Triton X⁃100，2.5 mmol/L MgCl2，200µmol/L dNTP，0.25µmol/L的引物，300 ng模板DNA和2.0 U Taq DNA聚合酶。扩增条件：94℃预变性5 min，94 ℃ 变性 30 s，61 ℃ 退火 4 s，72 ℃ 延伸 90 s，共30个循环，最后72℃延伸10 min。扩增片段长度为1.3 kb，PCR扩增产物包括ER基因的1个内含子和2个外显子。

1.2.4 扩增产物限制性酶切及凝胶电泳分析 将PCR产物20µL分别用5 U XbaⅠ和PvuⅡ限制性内切酶进行酶切消化3 h，酶切产物在含0.5 mg/L溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶中以110 V稳压电泳30 min，用紫外线凝胶成像系统观察结果。在1.3 kb片段中检测XbaⅠ和PvuⅡ的多态性部位。

1.3 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件进行数据分析，采用Pearson相关性分析；采用双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCR及酶切结果 根据XbaⅠ限制性内切酶酶切消化将ER分为存在XbaⅠ酶切位点和不存在XbaⅠ酶切位点2类；存在XbaⅠ酶切位点者分为xx型和杂合子Xx型，其中xx型位于910、390bp；Xx型位于1.3kb，910、390 bp；不存在XbaⅠ酶切位点者为XX型，位于1.3 kb；PvuⅡ限制性内切酶酶切消化将ER分为存在PvuⅡ酶切位点和不存在PvuⅡ酶切位点2类；存在PvuⅡ酶切位点者分为纯合子pp型和杂合子Pp型，其中pp型位于 850、450 bp；Pp 型位于 1.3 kb，850、450 bp；不存在PvuⅡ酶切位点者为PP型，位于1.3 kb。见图1。

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图1 不同酶切电泳ER基因分型

2.2 三组研究对象ER基因分型及频率比较 三组研究对象基因型分布均符合Hardy⁃Weinberg定律，具有群体代表性。A、B组研究对象中均无XX型者，C组研究对象中XX型3例（因例数太少，故未对此基因型进行比较）。三组研究对象ER基因型分布中均以PP型出现的频率最低，但组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1、2，图2、3。

表1 A、B组研究对象ER基因分型及频率比较

表2 A、C组研究对象ER基因分型及频率比较

2.3 三组研究对象ER基因多态性比较 A、B组研究对象均无 XXPP、XXPp、XXpp、Xxpp型者，A、B 组研究对象ER基因多态性中XxPP、xxPP、xxPp型出现频率较低，但组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3、图4。A、C 组研究对象均无 XXPp、XXpp、Xxpp 型者，A组患者中XxPP、xxPP型各3例，而C组研究对象中无相应基因型者，且C组研究对象中XXPP型3例，但A组患者中无 XXPP型者，故未对 XxPP、xxPP、XXPP型进行比较；C组研究对象ER基因多态性中xxPp型出现频率较低，但与A组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图5。

图2 A、B组研究对象ER基因型分布比较

图3 A、C组研究对象ER基因型分布比较

表3 A、B组研究对象ER基因多态性比较

图4 A、B组研究对象ER基因多态性比较

表4 A、C组研究对象ER基因多态性比较

图5 A、C组研究对象ER基因多态性比较

3 讨 论

腱鞘炎是临床常见病、多发病，病情较轻者表现为患处疼痛，病情较重者伴患指活动受限，使患者生活及工作均受到严重影响[5]。

目前认为，主要是因腱鞘反复受机械性摩擦而引起的慢性无菌性炎症。机械性摩擦刺激导致腱鞘发生充血、水肿、渗出等无菌性炎性反应，反复发生的炎性反应使纤维结缔组织发生增生、肥厚、粘连等变化，从而导致“骨⁃纤维隧道”狭窄，进而压迫本已水肿的肌腱，使肌腱变性，从而使患指出现疼痛、活动障碍等临床表现。但腱鞘炎发病的真正病因尚未阐明，是由单因素引发，还是多因素共同作用的结果临床医生尚未达成共识。

腱鞘炎患者男女比例为10∶1，尤其是哺乳期或更年期女性发病率更高。很多学者通过长期观察发现，妊娠、哺乳和绝经后女性腱鞘炎发病率明显升高，提示性激素，特别是雌激素在腱鞘炎发病中可能具有重要作用[6⁃7]。

人ER由595个氨基酸残基组成，相对分子质量为67×103。按受体所在部位分为核性ER（包括ERα和ERβ）[8]和膜性 ER（GPER1、Gap⁃ER、ER⁃X）[9⁃10]。人 ER基因位于6号染色体长臂2区4带至6号染色体长臂2区7带这一区间，包括8个外显子和7个内含子[11]。1号内含子中有2处可以发生点突变，由于这2处点突变发生在限制性内切酶XbaⅠ和PvuⅡ的识别位点上，因此，对ER基因的扩增片段进行酶切便可以区分ER的不同基因型。不同的基因型有可能决定不同个体ER的表达水平和功能的差异，从而影响体内雌激素的生物学作用[8]。

本研究横向比较了绝经期腱鞘炎患者与绝经期健康女性及非绝经期健康女性ER基因型及多态性分布情况，探讨了ER基因型与绝经后妇女腱鞘炎发病的关系。结果表明，A组患者ER基因型分布中Xx、xx、PP、Pp、pp 型分别占 43.750%、56.250%、12.500%、50.000%、37.500%，B组研究对象分别占 42.857%、57.143%、19.048%、47.619%、33.333%，C组研究对象分别占 42.857%、52.381%、4.762%、57.143%、38.095%，三组研究对象ER基因型分布中均以PP型出现的频率最低，但组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。所以，虽然PP型出现频率较低，但尚不能认为其是腱鞘炎的低患病基因（保护基因）。

本研究结果显示，A组患者ER基因多态性中XxPP、XxPp、xxPP、xxPp、xxpp 型分别占 6.250%、37.500%、6.250%、12.500%、37.500%，B组研究对象分别占9.524%、33.333%、9.524%、14.286%、33.333%；C组研究对象 ER基因多态性中 XxPp、xxPp、xxpp型分别占42.857%、14.286%、38.095%；A、B组研究对象ER基因多态性中XxPP、xxPP、xxPp型出现频率较低，C组研究对象ER基因多态性中xxPp型出现频率较低，但组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。所以，虽然 XxPp、xxpp型出现频率较高，尚不能认为XxPp、xxpp型为绝经后女性腱鞘炎的易感基因（患病基因）。

由于本研究只对核性ER进行了分析，且研究对象样本量相对较少，研究结果可能存在一定的偏倚。目前，对膜性ER的研究发现，膜性ER在女性相关疾病的发生、发展中同样具有非常重要的作用[9，11]。对女性腱鞘炎在哺乳期及绝经期高发的现象尚需进行大样本、多中心协作的更深入研究，才能为女性腱鞘炎的防治提供更有力的指导。

参考文献

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