高效液相色谱法测定羟基喜树碱在不同有机溶剂和增溶剂中的平衡溶解度*

刘晓芳，王 婴，李木生，聂 晶，张 昕，王 岩（广东药科大学，广东广州510006）

羟基喜树碱（HCPT）来源于中国特有植物喜树，是一种拓扑异构酶Ⅰ抑制剂[1⁃2]，可特异性作用于拓扑异构酶Ⅰ，通过抑制DNA复制而发挥抗癌作用。作为喜树碱结构A环上的第10位氢原子被羟基取代而形成的衍生物——HCPT活性更高而毒性较低，抗癌作用是喜树碱的30倍[3⁃4]。HCPT是中国学者独立研发的喜树碱衍生物，具有显著的抗癌活性和较广的抗癌谱，不易与其他常用抗癌药物形成交叉耐药性，可广泛用于治疗各种恶性肿瘤，如肝癌、胃癌、头颈部肿瘤、白血病、膀胱癌等[5⁃7]，是目前我国临床应用较多的喜树碱类药物。

HCPT微溶于甲醇、氯仿等有机溶剂，不溶于水，见光不稳定，与酸不能形成盐，遇碱不稳定，易开环形成钠盐。本研究建立了HCPT的高效液相色谱（HPLC）法，比较了其在不同有机溶剂和增溶剂中的平衡溶解度，为进一步研发其新剂型奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 ZD⁃85气浴恒温振荡器（常州市伟嘉仪器制造有限公司）、LC⁃10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、Diamonsil C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5µm，德国迪马公司）、AY120托盘电子分析天平（日本岛津公司）、TU⁃1901型双光束紫外可见光光度计（北京普析通用仪器公司）等。

1.1.2 试剂与药品 HCPT原料药（南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY20150901），HCPT对照品（南通飞宇生物科技有限公司，批号：FY16951008），甲醇、N，N⁃二甲基甲酰胺、聚乙二醇⁃400（PEG⁃400）、PEG⁃4000（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），氯仿（分析纯，天津致远化学试剂有限公司），二甲基亚砜、乙酸乙酯、吐温⁃80（分析纯，天津市百世化工有限公司），甘油（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），聚氧乙烯氢化蓖麻油（分析纯，德国BASF公司），十二烷基硫酸钠（SDS，分析纯，天津福晨试剂有限公司），甲醇（色谱纯，瑞典Oceanpak公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立HCPT含量测定方法[8−9]

1.2.1.1 选择检测波长 取适量HCPT溶解于甲醇中，经适当稀释后以甲醇作为空白对照溶液，于200～400 nm波长下进行扫描以确定检测波长，并绘制紫外吸收光谱图。

1.2.1.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Dia⁃monsil C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5µm）；流动相为甲醇∶磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=5.0）=60∶40；检测波长为384 nm；柱温为30℃；流速为0.6 mL/min；进样量为20µL。理论塔板数按HCPT峰计算应不小于2 000。

1.2.1.3 制备对照品溶液 精密称取已干燥至恒重的HCPT对照品9.9 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度线，摇匀静置，即得99µg/mL的HCPT对照品溶液。

1.2.1.4 制备供试品溶液 精密称取已干燥至恒重的HCPT原料药3.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容至刻度线，即得HCPT供试品溶液。

1.2.1.5 专属性考察 精密吸取20µL甲醇空白对照溶液、HCPT对照品溶液、HCPT供试品溶液按1.2.1.2项下色谱条件进样检测，记录HPLC色谱图。

1.2.1.6 制备标准曲线 精密量取一系列剂量（分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL）的 HCPT 对照品溶液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得质量浓度分别为 0.99、1.98、3.96、7.92、15.84、31.68、63.36 µg/mL的标准溶液。按1.2.1.2项下色谱条件进样检测，以药物质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程。

1.2.1.7 精密度考察 精密量取适量HCPT对照品溶液于10 mL棕色容量瓶中，配制高（9.90µg/mL）、中（4.95µg/mL）、低（0.99µg/mL）3个质量浓度的 HCPT对照品溶液。按1.2.1.2项下色谱条件进样检测，每天吸取高、中、低3个质量浓度的HCPT对照品溶液进样检测，重复进样5次，连续进样5 d。记录峰面积，计算药物质量浓度及相对标准偏差（RSD）值。

1.2.1.8 重复性考察 精密称取同一批号HCPT原料药3.0 mg，按1.2.1.4项下平行制备供试品溶液6份，按1.2.1.2项下色谱条件进样检测，记录峰面积，计算RSD值。

1.2.1.9 稳定性考察 按1.2.1.4项下制备供试品溶液，于室温下放置，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 后进样检测，记录峰面积及RSD值。

1.2.2 HCPT在不同有机溶剂中的平衡溶解度测定[10⁃11]取HCPT原料药10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，分别加入甲醇、氯仿、氯仿⁃无水乙醇（7∶3）、二甲基亚砜、乙酸乙酯、N，N⁃二甲基甲酰胺、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇9种有机溶剂，超声溶解药物，分别定容至刻度线，置于气浴恒温振荡器，于（37.0±0.5）℃振荡48 h以达到平衡状态，吸取上清液，经0.45µm滤膜滤过后取续滤液，按1.2.1.2项下色谱条件检测，记录峰面积，计算平衡溶解度。

1.2.3 HCPT在不同增溶剂中的平衡溶解度测定 取HCPT原料药10.0 mg于10 mL棕色容量瓶中，分别加入不同体积分数（0.1%、0.5%、1.0%）吐温⁃80、PEG⁃400、PEG⁃4000、泊洛沙姆 F⁃68、甘油、RH⁃40、SDS 7 种增溶剂，超声溶解药物，分别定容至刻度线，置于气浴恒温振荡器中，于（37.0±0.5）℃振荡48 h以达到平衡状态，吸取上清液，经0.45µm滤膜滤过后取续滤液，按1.2.1.2项下色谱条件进样检测，计算平衡溶解度。

2 结 果

2.1 HCPT含量测定方法的确定

2.1.1 检测波长 HCPT在222、266、384 nm处均有吸收，因紫外线末端吸收有干扰，故选择384 nm为检测波长。见图1。

图1 HCPT紫外吸收光谱图

2.1.2 专属性 当检测波长为384 nm时，HCPT对照品溶液的出峰时间为8.3 min，分离度良好，且HCPT供试品溶液出峰时间与对照品溶液保持一致，空白对照溶液无干扰，表明专属性良好。见图2。

图2 HCPT的HPLC色谱图

2.1.3 线性标准曲线 线性回归方程为Y=51 875X+395 188，R2=0.999，表明 HCPT 在 0.99～63.36µg/mL 范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度 高、中、低3个质量浓度HCPT对照品溶液日内、日间精密度RSD均小于3.000%，表明精密度良好。见表1。

表1 HCPT精密度考察结果

2.1.5 重复性 6份供试品溶液RSD为2.784%（＜3.000%），表明重复性良好。

2.1.6 稳定性 供试品溶液在室温下放置12 h后RSD为2.708%（＜3.000%），表明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2 HCPT在不同有机溶剂中的平衡溶解度 HCPT在N，N⁃二甲基甲酰胺中的平衡溶解度最高，二甲基亚砜次之。氯仿和乙酸乙酯对HCPT的平衡溶解度均很低，但氯仿加入无水乙醇后平衡溶解度大幅度升高。不同体积分数的乙醇溶液对HCPT的平衡溶解度也不一样，溶解度随体积分数的提高而升高。平衡溶解度从高至低分别为N，N⁃二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿⁃无水乙醇（7∶3）、甲醇、30% 乙醇、20% 乙醇、乙酸乙酯、氯仿、10%乙醇。见表2。

表2 HCPT在不同有机溶剂的平衡溶解度（±s，µg/mL，n=3）

表2 HCPT在不同有机溶剂的平衡溶解度（±s，µg/mL，n=3）

平衡溶解度766.156±0.019 7.677±0.153 1 372.361±0.012 1 406.130±0.016 7.679±0.068 1 674.477±0.032 5.015±0.047 15.183±0.028 53.845±0.015有机溶剂甲醇氯仿氯仿⁃无水乙醇（7∶3）二甲基亚砜乙酸乙酯N，N⁃二甲基甲酰胺10%乙醇20%乙醇30%乙醇

2.3 HCPT在不同增溶剂中的平衡溶解度 1%SDS溶液对HCPT的平衡溶解度最高。随着各增溶剂体积分数的提高，HCPT的平衡溶解度也随着升高，其中PEG⁃400、PEG⁃4000、甘油的升高趋势不明显，RH⁃40、SDS 则具有明显的升高趋势。平衡溶解度从高至低分别为SDS、RH⁃40、吐温⁃80、PEG⁃4000、甘油、泊洛沙姆 F⁃68、PEG⁃4000，见表3。

表3 HCPT在不同增溶剂的平衡溶解度（±s，µg/mL，n=3）

表3 HCPT在不同增溶剂的平衡溶解度（±s，µg/mL，n=3）

增溶剂名称吐温⁃80 PEG⁃400 PEG⁃4000 F⁃68甘油RH⁃40 SDS平衡溶解度0.1%2.055±0.023 1.372±0.045 2.266±0.017 1.482±0.036 1.937±0.039 1.647±0.056 2.532±0.033 0.5%2.536±0.042 1.494±0.025 2.367±0.035 1.819±0.058 1.996±0.018 3.789±0.048 26.930±0.046 1.0%5.216±0.018 1.564±0.038 2.556±0.024 2.011±0.017 2.075±0.045 6.055±0.025 60.853±0.016

3 讨 论

本研究应用HPLC建立了HCPT的含量测定方法，确定了HCPT的高效液相条件，方法学考察表明，该方法专属性良好，精密度、重复性及稳定性的RSD均小于3.000%，适用于HCPT原料药及相关制剂的分析检测。绘制HCPT紫外吸收光谱图时HCPT在266、384nm处均有强度相近的吸收。因许多溶剂与药用辅料在200 nm附近有明显吸收而造成末端吸收干扰，故选择384 nm为检测波长，与大多数文献报道结果一致[8⁃9]。

平衡溶解度是指在一定条件下药物在某一溶剂中达到饱和状态所溶解的最大量，是反映药物溶解性能的物理参数[11]。本研究采用气浴振荡法，检测了HCPT的平衡溶解度，该方法可促进药物分子热运动，缩短达到溶解平衡的时间[12]，且操作简单。HCPT为难溶性药物，脂溶性弱，水溶性极差。难溶性问题不仅会限制其在临床的应用，给其新剂型的研发带来困难[13]，还会影响药物的溶出，降低其生物利用度。近年来，越来越多的学者研究了HCPT脂质体、纳米粒、微乳等制剂，试图提高HCPT的溶解度，增强稳定性，提高生物利用度，实现靶向性输送[14⁃16]。本研究比较了HCPT在不同有机溶剂和增溶剂中的平衡溶解度，为该药物新剂型的处方设计、工艺研究、释药实验等提供了有力依据。

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