中草药对虹鳟稚鱼免疫力的影响

胡国宏 徐有国 金香琴 熊占山 张家松

提要：本实验用自配提高鱼体非特异性免疫力中药方剂，加工成药饵饲喂虹鳟稚鱼。试验池连续喂12天药饵，对照池不喂药饵。测定了试验鱼和对照鱼的组织和血液的免疫学指标。结果试验池和对照池30天的死鱼数分别为2487尾和4965尾，存活率分别为92.32%和76.93%。实验组比对照组高15个百分点。而且试验池比对照池晚发病一周。实验组和对照组组织样品的免疫学指标无显著差异。由图2可看出，实验组和对照组血液样品的免疫学指标差异显著。实验组鱼血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-1β、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（ALP）、肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ等六种免疫相关酶显著高于对照组。这表明，我们配出的中药方剂具有提高虹鳟稚鱼非特异性免疫力的效果。

前言：我国冷水鱼（尤其是虹鳟）的养殖技术已经很成熟。然而，到2016年我国鲑鳟鱼产量仅为4万吨，远远满足不了国内消费需求。每年需要大量进口。根据我国冷水资源估算，鲑鳟鱼的生产潜力为50～60万吨，开发利用前景广阔。随着养殖规模的逐年扩大，病害威胁日益严重。特别是病毒病（传染性造血器官坏死病等）给养殖业带来了巨大危害和经济损失。可见，疾病的发生是制约水产养殖业发展和增加收益的主要因素之一。

目前，人类普遍关注食品安全问题。过去用于防治鱼病的西药，有很多已经禁用或限用。利用高效、低毒、无残留的中草药防治鱼病已成为必然趋势。

1. 材料与方法

1.1中药方剂配伍

针对免疫力低、发病率高，而配制提升鱼体非特异免疫力方剂。本方组成如下：黄芪、肉丛蓉;川芎、金银花、红花、五味子、柴胡;鱼腥草、白花蛇舌草;石斛;白术、白头翁、绞股蓝、桑螵蛸、甘草、板蓝根、天麻等25味。

1.2药饵的制作与投喂

将配好的中药粉碎后，以1%的剂量添加到已配好的饲料原料中，充分搅拌混匀后制成直径1.5mm的颗粒。

在2个面积5m2的流水池中，放入平均体重为4.38g 的虹鳟稚鱼。试验池放14800尾，对照池放12600尾 。试验池投喂药饵，对照池投喂正常饲料。并记录试验池和对照池的死鱼数。试验池连续喂12天药饵，死鱼数记录30天。

1.3免疫学指标的测定

试验池连续喂12天药饵后，试验池和对照池各取6尾鱼采组织样品，各取10尾鱼采血液样品，用上海仁捷生物科技有限公司ELISA检测试剂盒，分别检测：超氧化物歧化酶（SOD）、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-1β、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（ALP）、肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ等6种免疫相关酶。

用预冷的PBS （0.01M， pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液，称重0.1g后将组织剪碎。将剪碎的组织与900μLPBS加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。最后将匀浆液于5000×g离心5～10分钟， 取上清检测。

将收集于血清分离管的全血在室温放置2小时，然后1000×g离心20分钟，取上清检测。

具体检测方法如下：

① 设置标准品孔和样本孔， 标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL;

② 样本孔中加入待测样本 50μL; 空白孔不加。

③ 除空白孔外， 標准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（ HRP） 标记的检测抗体100μL， 用封板膜封住反应孔， 37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。

④弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（ 350μL），静置 1min，甩去洗涤液， 吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次。

⑤ 每孔加入底物 A、 B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。

⑥每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm 波长处测定各孔的OD值。

2. 结果与讨论

试验池和对照池30天的死鱼数分别为2487尾和4965尾，存活率分别为92.32%和76.93%。实验组比对照组高15个百分点。而且试验池比对照池晚发病一周。

组织免疫学指标检测结果见图1;血清免疫学指标检测结果见图2。

由图1可看出，实验组和对照组组织样品的免疫学指标无显著差异。由图2可看出，实验组和对照组血液样品的免疫学指标差异显著。实验组鱼血清中的超氧化物歧化酶（SOD）、干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-1β、过氧化氢酶（CAT）、碱性磷酸酶（ALP）、肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ等六种免疫相关酶显著高于对照组。这表明，我们配出的中药方剂具有提高免疫力的效果。