miRNA生物合成相关基因的遗传变异与胃癌患者生存的关系

廖瑜露 李 俊 万以叶 彭丽香 廖瑜倩

全世界范围内，胃癌是第5大最常见恶性肿瘤，死亡率在恶性肿瘤中居第三位[1]。早期胃癌可能通过根治性手术及辅助化疗等治疗手段达到治愈。两项随机、Ⅲ期临床研究证实，在根治性手术的基础上给予替吉奥[2]或奥沙利铂联合卡培他滨[3]方案辅助治疗可进一步提高生存期。

miRNA生物合成的关键基因如DICER、RAN、XPO、EPO、GEMIN可能与黑色素瘤、卵巢癌和T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤的发生、发展相关[4-6]。本研究在接受奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物术后辅助化疗的早期及局部晚期胃癌患者中分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs2257082，XPO5 rs11077遗传变异与患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)的相关性。

1 材料与方法

1.1 临床资料

回顾性分析2011年1月至2012年12月在我院就诊、病例资料较为完整、接受根治性手术，接受奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物术后辅助化疗的胃腺癌患者96例。根据AJCC分期(美国癌症分期联合委员会，2010年第7版)为Ⅰ～Ⅲ期[7]。排除接受姑息性手术、接受过术前化疗或放疗的患者。

1.2 治疗方法

奥沙利铂联合氟尿嘧啶类药物方案辅助化疗[8-9]。具体方案：① 71例患者使用mFOLFOX6方案，奥沙利铂85 mg/m2第1天+亚叶酸钙400 mg/m2第1天+氟尿嘧啶400 mg/m2第1天，静脉推注+氟尿嘧啶2 400 mg/m2持续泵入46 h，14天为1个周期，共12个周期。②12例患者使用奥沙利铂130 mg/m2第1天+亚叶酸钙300 mg第1～4天+替加氟1 g第1～4天，21天为1个周期×8个周期。③8例患者使用XELOX方案，奥沙利铂130 mg/m2+卡培他滨1 000 mg/m2bid第1～14天口服，21天为1个周期×8个周期。④5例患者使用SOX方案，奥沙利铂130 mg/m2+替吉奥40～60 mg bid 第1～14天口服，21天为1个周期×8个周期。

1.3 SNP检测方法

化疗前采集所有患者的外周血标本5 ml。采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA。采用MassARRAY MALDI-TOF 系统进行基因分型[10]，由北京博淼生物公司进行。检测位点：DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs11077和XPO5 rs2257082。所有标本检测两次，并设立不含DNA的阴性对照。两次检测的一致率为100%[8]。见表1。

表1 PCR引物

1.4 研究终点和统计学方法

每3个月进行影像学检查了解患者复发转移情况。无病生存期(DFS，disease-free survival)指从手术确诊开始至出现疾病复发或转移的时间。总生存期(OS，overall survival)指从手术确诊至因任何原因死亡或末次随访的时间。统计分析采用SPSS 18.0软件。所有的统计检验均为双侧概率检验。采用Kaplan-Meier 法进行单因素生存分析，组间比较采用Log-rank检验，采用COX风险比例模型进行多因素预后分析。

2 结果

2.1 全组患者基本特征

全组患者中位年龄54岁(19～79岁)。年龄<60岁及≥60岁的患者分别为67例(69.8%)和29例(30.2%)。67例患者为男性(69.8%)。仅有8例患者病灶位于贲门部(8.3%)。高中分化腺癌26例(27.1%)，低分化腺癌及印戒细胞癌患者70例(72.9%)。绝大多数患者为T3-4(77例，80.2%)。多数患者存在淋巴结转移(68例，70.8%)。Ⅲ期患者60例(62.5%)，见表2。

2.2 临床病理特征与DFS和OS的关系

全组患者2年DFS为60.5%，3年OS为73.2%。分析临床病理特征与DFS、OS的相关性。结果显示，T1-2患者的2年DFS显著高于T3-4患者，分别为88.2%和53.1%(P=0.014)。临床分期与2年DFS显著相关，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者2年DFS分别为100.0%、66.5%和50.4%(P=0.023)。

N分期(P=0.017)、临床分期(P=0.020)与3年OS显著相关。淋巴结转移患者的3年OS显著低于无淋巴结转移患者，分别为63.7%和88.6%。见表2。

表2 临床病理特征与患者生存的关系/%

2.3 基因型与DFS和OS的关系

分析DICER rs13078，DICER rs3742330，RAN rs14035，XPO5 rs11077，XPO5 rs2257082基因型与2年DFS及3年OS的关系，结果提示，XPO5 rs11077基因型与3年OS显著相关，AC基因型患者的3年OS显著低于AA基因型患者，见表3。

多因素预后分析显示，淋巴结状态(P=0.033，RR:5.033,95%CI:1.140～22.224)及XPO5 rs11077基因型(P=0.045，RR:0.307,95%CI:0.096～0.976)为3年OS的独立预后因素。

表3 基因分型与生存的关系/%

3 讨论

人类miRNA的生物合成分为两个阶段。首先，编码miRNA的基因转录出初级miRNA(pri-miRNA)；pri-miRNA在细胞核中被RNaseIIIDROSHA切割成60～70个核苷酸的前体miRNA(pre-miRNA)。然后，pre-miRNA借助RAN-GTPase(RAN)依赖性Exportin-5(XPO5)从核内转运至胞质，由RNaseIIIDICER进一步切割产生成熟的miRNA。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC，RNA-induced silencing complex)，从而引起靶mRNA的降解或者翻译抑制[11]。遗传变异是影响基因表达或功能的重要作用机制，miRNA合成相关基因的遗传变异可导致miRNA合成相关蛋白表达的异常，从整体水平影响miRNA的表达和功能，影响多种肿瘤的发生及预后[12]。

已有研究证实rs11077基因多态与我国小细胞肺癌[13]、非小细胞肺癌[14]及肝癌[15]等恶性肿瘤患者预后相关。Guo等[13]对42例小细胞肺癌患者检测rs11077基因型，发现携带AA基因型患者的生存期明显长于携带AC+CC基因型者(P=0.023)，rs11077基因型是独立预后因素。Ding等[14]在接受铂类药物治疗的112例非小细胞肺癌患者中分析了rs11077与患者疗效及生存的关系，发现AC基因型患者化疗疗效优于AA基因型患者，AC基因型患者的生存期长于AA基因型患者。Liu等[15]在肝细胞癌患者中分析了miRNA生物合成相关基因多态与患者预后的关系，发现rs11077 AA基因型患者的生存差于AC及CC基因型患者。

XPO5 rs11077影响恶性肿瘤患者生存的机制还不明了。在结肠癌细胞株中[16]，XPO5突变及失活可导致miRNA生物合成减少及miRNA靶向抑制的降低，而复活XPO5则可恢复miRNA由细胞核至细胞质的转运并起到抑制肿瘤的作用。rs11077多态位于XPO5基因的3’非编码区(3’UTR)，可能影响XPO5的表达水平，进而影响肿瘤患者的生存期。由于在不同研究中，基因型与预后的关系有所不同，一些学者认为在不同类型的肿瘤细胞中，SNP对miRNA的调节作用可能有所不同[15]。

目前尚未见miRNA生物合成相关基因多态与胃癌预后的相关研究。我国学者[17]曾对XPO5 rs11077、RAN rs14035、DICER rs3742330、TNRC6B rs9623117、GEMIN3 rs197412以及GEMIN4 rs2740348与胃癌易感性的关系进行研究，发现携带RAN rs14035 CC基因型、DICER rs3742330 AA基因型、TNRC6B rs9623117 TT基因型者胃癌发生风险高。我们在接受奥沙利铂及氟尿嘧啶类药物辅助治疗的胃癌患者中，对miRNA生物合成相关基因的SNP进行研究，发现XPO5 rs11077 基因型与胃癌患者预后相关，携带AC基因型的患者预后更差。本研究中无1例患者为CC基因型，与文献报道的中国人群中CC基因型少于1%一致[13-15]。

本研究中，DICER rs13078、DICER rs3742330、RAN rs14035、XPO5 rs2257082基因型与胃癌患者生存均无明显相关性。也有学者对这些基因多态与淋巴瘤[18]及肝细胞癌[19]患者生存的关系进行了研究，结果也不一致。DICER rs13078与肝癌患者生存无关，DICER rs3742330与肝癌及T细胞淋巴瘤生存相关，RAN rs14035与肝癌患者预后相关但与非霍奇金淋巴瘤生存无关。由于本研究及上述研究病例数均有限，还需扩大样本量进行验证。

综上所述，本研究显示XPO5 rs11077 基因型与接受奥沙利铂及氟尿嘧啶类药物辅助化疗的非转移性胃癌患者预后相关，是独立的预后因素，携带AC基因型的患者预后更差。本研究纳入的病例数及检测位点有限，为了进一步验证本研究的结果，更好的阐明miRNA生物合成相关SNP在胃癌发生、发展中的作用，还需要扩大样本量，增加检测位点，进行更为深入的机制研究。

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