外泌体作为非小细胞肺癌诊断标志物的研究进展

王赛斌 吕镗烽 涂军伟 宋勇

外泌体(exosomes)是具有脂质双层膜结构、直径为30～100 nm的微小囊泡，是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程后由细胞主动分泌的一种物质。外泌体的产生和分泌受多种蛋白质精确调节[1]。在正常或应激条件下，几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体，如网织红细胞、树突状细胞、脂肪细胞、内皮及上皮细胞等。与来源同一组织器官类型的正常细胞相比，肿瘤细胞能分泌更多的外泌体。

外泌体内含丰富的生物活性分子，包括蛋白质、核酸及脂质。这些分子被外泌体携带进入血液循环，而后被一定距离外的靶细胞吸收，最终实现调节靶细胞基因表达和细胞功能。研究表明，外泌体能影响肿瘤微环境的形成、增强肿瘤细胞侵袭与转移能力、介导肿瘤免疫抑制及参与肿瘤放化疗抵抗进而促进肿瘤发生与发展[2]。此外，外泌体因携带经分选的生物活性物质，天然具备了作为疾病生物标志物的潜在价值[3]。

目前，外泌体数据库“ExoCarta database”(http://www.exocarta.org)中关于外泌体的研究数量在不断增加。外泌体作为疾病的研究对象，特别是在肿瘤领域的研究是目前的一个热点。肺癌是一种高度致死的疾病，针对肺癌治疗领域的研究近年来取得了不少进展，但肺癌5年生存率并没有改善[4]。其中，疾病得不到早期诊断及肿瘤发生早期转移是主要原因之一。因此，寻找肿瘤生物标志物用以疾病早期诊断是一项十分有意义研究。本文对近年外泌体作为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)诊断标志物价值的研究进展作一综述。

一、外泌体作为疾病诊断标志物概述

1. 外泌体的组成及特点： 外泌体内含有的蛋白质主要包括两类：一类是在外泌体中普遍存在的蛋白，如四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81及CD82)、热休克蛋白(HSP60、HSP70及HSP90)、肿瘤易感基因101蛋白(tumor susceptibility gene 101, TSG101)及ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X, Alix)；另一类蛋白则是与外泌体亲代来源细胞相关。外泌体中的核酸来源于亲代细胞，包括单链或双链DNA、线粒体DNA，RNA如信使RNA(mRNA)、核糖体RNA、微小RNA(miRNA)以及非编码RNA(noncodingRNA, ncRNA)；脂质成分主要为胆固醇、二酰甘油、鞘磷脂、甘油磷脂和饱和脂肪酸等[5]。外泌体存在于多种体液，包括血浆、血清、精液、尿、唾液、乳腺、牛奶、羊水、腹水、脑脊液和胆汁。在外泌体分离技术方面，目前比较常用的方法有差速离心法、蔗糖密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法和多聚物沉降法等。这些方法各有优缺点，其中, 差速离心法在文献中报道较多。

随着分子生物学的发展，“液态活检”的技术正逐渐兴起。该技术具有无创性及检测样本易获取性，在某些领域有逐渐取代传统组织活检的趋势。其中，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)、无细胞循环DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)及外泌体是“液态活检”的三种主要方式。CTCs已被证明是良好的肿瘤转移性进展风险的预测因子，也可用于监测疾病的治疗反应；而ctDNA作为可能的肿瘤生物标志物和预后因子目前正处于研究中，难以标准化是其面临的重大挑战[6]。循环外泌体相对于其他液态活检所具有的优势是：外泌体选择性携带亲代细胞的生物活性物质，如miRNA；外泌体脂质双层膜能保护RNA免于降解，磷酸化蛋白在循环中免于去磷酸化，而磷酸化的蛋白在肿瘤中更具生物标志物价值；外泌体降低生物流体的复杂性，从而有助于更具体、灵敏地检测低丰度的分子[7]。

2. 外泌体在疾病中作为诊断标志物的价值： 外泌体通过细胞释放进入循环和体液。研究表明，在健康受试者和患者中外泌体具有不同的蛋白质和RNA含量，这是其具备诊断标志物价值的基础[8]。相关研究主要集中于肿瘤，包括胰腺癌、前列腺癌、胃癌、口咽鳞状细胞癌、食管癌和肺癌等肿瘤的诊断；也有应用于非肿瘤性疾病，如帕金森氏病的诊断[9]。

外泌体携带的蛋白质组成与亲代细胞蛋白质组学不同，这表明外泌体是选择性包装亲代细胞蛋白质，相关机制目前了解尚少，但可能涉及四次跨膜蛋白和其他蛋白之间的相互作用，与跨膜蛋白在膜中形成蛋白复合物微结构域有关。血清外泌体磷脂酰肌醇蛋白多糖-1(GPC1)阳性在诊断胰腺癌患者时具有100%的特异性和敏感性；前列腺癌患者尿液中的外泌体TM256(跨膜蛋白256)同样具有非常高的诊断敏感性(94%)和特异性(100%)[10]。这些研究结果振奋人心。

肿瘤具有独特的miRNA表达谱，肿瘤细胞来源的外泌体富含miRNA可用作肿瘤诊断标记物[11]。Huang等[12]研究提示外泌体miR-1290和miR-375是去势治疗失败前列腺癌有价值的诊断标志物；Cazzoli等[13]发现了具有潜力的筛选和诊断肺腺癌的外泌体miRNA；肝脏移植后血清外泌体miRNA水平的增加可以提示肝癌的复发；循环外泌体EGFRvⅢmRNA水平的增加可以诊断胶质母细胞瘤，从而避免通过外科手术活检脑组织来检测EGFRvⅢ蛋白。

目前，外泌体作为诊断标志物在非肿瘤疾病中也被广泛研究。在神经系统中，脑脊液外泌体tau蛋白可用于早期阿尔茨海默病的诊断，而血清外泌体溶酶体蛋白有助于区分临床前阿尔茨海默病和痴呆患者[14]。血清外泌体蛋白质组学还可用于诊断帕金森氏病患者[9]。在哮喘患者中，来自支气管肺泡灌洗液的外泌体与健康对照者表现出不同的miRNA谱；血清外泌体miR-192水平增加可以预测急性心肌梗死后患者心力衰竭的发生发展[15]。此外，外泌体作为诊断标志物也被用于泌尿系统疾病、肝脏疾病和血管性疾病[16-17]。所有这些研究都为众多疾病的诊断开启了新的视窗。

二、外泌体在NSCLC中的诊断价值

肺癌具有很高的发病率和病死率，NSCLC的5年生存率与诊断时的肿瘤分期相关[18-19]。大多数肺癌患者出现局部症状或转移相关症状时已错过了最佳治疗时机，因此肺癌早期诊断至关重要。目前，采用低剂量计算机断层扫描(low dose CT, LDCT)对肺癌进行筛查，能有效减少肺癌负担[20-21]。但是LDCT具有明显的缺点，包括过度诊断、辐射暴露和患者长时间承受心理压力。近年来，肺癌靶向治疗的兴起对肿瘤诊断提出了新的要求。因此，寻找非侵入性或微创性、具有高敏感性和特异性的生物诊断标志物是临床迫切需要解决的问题。

1. 外泌体蛋白质： 检测和分析肺癌细胞来源外泌体蛋白有助于肺癌的早期诊断[22]。有研究采用定位于外泌体膜的EGFR用于肺癌诊断[23]；Huang等[24]研究发现NSCLC患者肺组织外泌体表面EGFR免疫染色呈阳性的占80%，而慢性肺炎组织的外泌体EGFR呈阳性的只有2%的，因而他们认为外泌体EGFR蛋白可用作NSCLC和慢性肺炎鉴别诊断的生物标志物。孟祥宽等[25]检测分析了18例肺腺癌患者和9例正常对照者血清外泌体膜蛋白GPC1的表达，结果表明GPC1表达水平不仅与肺腺癌发生相关，而且与NSCLC分期相关，晚期NSCLC患者GPC1表达量更高。

将高通量质谱分析用于筛选NSCLC外泌体蛋白的研究揭示了更多具有生物标志物价值的分子。Birgitte等[26]采用微阵列芯片技术研究了431例肺癌患者和150例对照者血浆外泌体中的蛋白表达情况，通过分析发现CD151、CD171及tetraspanin 8 (TSPAN8)这三种蛋白表达不仅能区分肿瘤与正常组织，同时也能区分出各种肺癌组织亚型；联合应用这三种蛋白诊断NSCLC的ROC曲线下面积(Area Under Curve, AUC)达到0.74。Ueda等[27]采用抗CD9-MISA联合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术分析了46例患者血清外泌体，从中筛选出CD91分子对NSCLC的诊断敏感性为0.72，特异性0.60，AUC为0.89。Park等[28]采用Nano-LC-ESI-MS/MS技术结合生物信息学从NSCLC患者胸水外泌体中分析出包括EGFR在内的上百种具有潜在诊断价值的蛋白。而NSCLC患者尿液和肿瘤组织的外泌体中，Li等[29]运用质谱分析发现存在特异性表达蛋白富亮氨酸α-2-糖蛋白1，认为它可用作NSCLC潜在的诊断标志物。Clark等[22]同样采用Nano-ELS-MS/MS技术分析了来自正常支气管上皮细胞系和两个携带NSCLC细胞系的外泌体的蛋白表达谱，从中筛选出如细胞外基质金属蛋白酶诱导因子、溶酶体膜糖蛋白2等多种存在显著性差异表达的蛋白，同时检测分析这些蛋白有助于提高NSCLC诊断敏感性和特异性。蛋白微阵列芯片是高通量检测的另一种方法，可同时检测多种目标蛋白。Jakobsen等[30]采用胞外囊泡芯片技术从109例晚期NSCLC患者血清外泌体中检测发现多种具有高敏感性和特异性的蛋白，联合分析这些蛋白对晚期NSCLC患者的诊断灵敏度达到75%，特异度76%，见表1。

2. 外泌体核酸作为NSCLC诊断标志物： 血浆来源的外泌体miRNA的表达谱在肺癌患者和正常对照者中存在明显差异。在NSCLC患者中，患者的本身的个体差异、肿瘤组织的不同类型和不同病理分期使得miRNA表达谱不尽相同，但患者循环外泌体与肿瘤细胞外泌体中的miRNAs组分具有很强的相似性。在一项队列研究中，Rolfo等[31]发现，与健康对照组相比，NSCLC患者组血浆外泌体中与EGFR通路相关的miRNA-30b/30c发生了上调。Rodriguez等[32]发现肺部肿瘤患者血循环外泌体miR-122-5p等miRNA含量明显高于支气管肺泡灌洗液所测的结果。此外，在疾病的不同阶段，细胞外囊泡miRNA含量也不同，Silva等[33]研究发现血浆外泌体miR-30e-3p和let7f表达水平的差异可作为NSCLC患者早期和晚期区分的标志物，而且预后较差的NSCLC患者与其血浆中这些miRNA表达量下调有关。

高通量检测技术的发展促进了外泌体miRNA作为分子标志物的研究。Munagala等[34]采用miRNA的芯片技术检测了荷瘤小鼠血清外泌体中的miRNA表达谱，发现miR-21和miR-155表达增加有助于肺癌复发的诊断。Zhou等[35]采用qRT-PCR方法从肺腺癌患者血浆外泌体中鉴定出6种较正常对照者明显表达上调的miRNA，联合分析这些外泌体miRNA可有助于肺腺癌的诊断，见表2。

在临床应用方面，目前Exosome Diagnostics公司研发的基于血浆外泌体的ExoDx Lung(ALK)诊断试剂盒已于2016年初被美国FDA批准用于临床。这是世界上第一个以血液样本分析外泌体RNA的临床液体活检。这项方法可灵敏、准确、实时地检测NSCLC患者的EML4-ALK突变。通过比较患者组织ALK水平和相应的血浆样本发现该项检测可以达到88%的诊断灵敏度和100%的诊断特异性。而此前，对于EML4-ALK的检测是基于组织活检的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)或免疫组化(immunohistochemistry, IHC)，而且FISH缺乏灵敏性，误诊率也高。

表1 外泌体蛋白质作为NSCLC诊断标志物

注：NA：not available

表2 外泌体核酸作为NSCLC诊断标志物

注：NA：not available

三、总结和展望

外泌体具有成为多种疾病生物标志物的巨大潜力，但尚存在一些问题。首先，目前没有分离外泌体的标准化方法，部分个体研究的结果匹配欠佳，这可能与外泌体的分离与纯化的方法差异有关[36]。操作过程的标准化、均一化是外泌体在转化医学研究中面临的重要挑战；其次，在定量研究中尚缺乏对外泌体内参miRNA的滴定，一些研究认为miR-1228是良好内源性参照[31,37]，但仍需要更多的研究进行验证；第三，对外泌体尚存在精确分离、快速鉴定及灵敏检测的难题。

然而，越来越多的研究正在逐渐推进外泌体的临床应用，Wang等[38]利用DNA构建纳米结构和先进的适配技术，开发了DNA纳米四面体传感器，利用电化学特性检测肿瘤来源的外泌体，大大提升了检测的灵敏度。Xia等[39]通过整合具有优良水溶性的单壁碳纳米管和跨膜蛋白CD63的特异性核酸适体来检测外泌体，展示了一种可见且简单的方法，为外泌体的临床检测应用提供了可能。而微流体控制技术的发展使其具有了超高的空间分辨率和近乎单分子水平的精确操控性，并且具有样品使用的低耗性，这一方法已经显示出其在细胞外囊泡临床应用方面的巨大潜力[40]。总之，外泌体作为液态活检的主要手段之一，具有广阔的研究价值。相信在将来的转化医学研究中，外泌体有望作为肺癌良好的生物标志物，推进肺癌的早期诊断，并有助肺癌的治疗及预后监测。

参 考 文 献

1 Ruiz-Martinez M, Navarro A, Marrades RM, et al. YKT6 expression,exosome release, and survival in non-small cell lung cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(32): 51515-51524.

2 Frediani JN, Fabbri M. Essential role of miRNAs in orchestrating the biology of the tumor microenvironment[J]. Mol Cancer, 2016, 15(1): 42.

3 Munson P, Shukla A. Exosomes: Potential in Cancer Diagnosis and Therapy[J]. Medicines, 2015, 2(4): 310-327.

4 Chen Z, Fillmore CM, Hammerman PS, et al. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases[J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14(8): 535-546.

5 Thakur BK, Zhang H, Becker A, et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection[J]. Cell Res, 2014, 24(6): 766-769.

6 Yanagita M, Redig AJ, Paweletz CP, et al. A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase Ⅱ trial[J]. Clin Cancer Res, 2016, 22(24): 6010-6020.

7 Chen IH, Xue L, Hsu CC, et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114(12): 3175-3180.

8 Revenfeld AL, Baek R, Nielsen MH, et al. Diagnostic and prognostic potential of extracellular vesicles in peripheral blood[J]. Clinical Therapeutics, 2014, 36(6): 830-846.

9 Tomlinson PR, Zheng Y, Fischer R, et al. Identification of distinct circulating exosomes in Parkinson's disease[J]. Annals of Clinical Translational Neurology, 2015, 2(4): 353-361.

10 Zijlstra C, Stoorvogel W. Prostasomes as a source of diagnostic biomarkersfor prostate cancer[J]. J. Clin. Invest, 2016, 126(4): 1144-1151.

11 Schwarzenbach, H. The clinical relevance of circulating, exosomal miRNAs as biomarkers for cancer[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2015, 15(9): 1159-1169.

12 Huang X, Yuan T, Liang M, et al. Exosomal miR-1290 and miR-375 as prognostic markers in castration-resistant prostate cancer[J]. Eur Urol, 2015, 67(1): 33-41.

13 Cazzoli R, Buttitta F, Di Nicola M, et al. microRNAs derived from circulating exosomes as noninvasive biomarkers for screening and diagnosing lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2013, 8(9): 1156-1162.

14 Goetzl EJ, Boxer A, Schwartz JB, et al. Altered lysosomal proteins in neural-derived plasma exosomes in preclinical Alzheimer disease[J]. Neurology, 2015, 85(1): 40-47.

15 Matsumoto S, Sakata Y, Suna S, et al. Circulating p53-responsive microRNAs are predictive indicators of heart failure after acute myocardial infarction[J]. Circulation Research, 2013, 113(3): 322-326.

16 Huebner AR, Somparn P, Benjachat T, et al. Exosomes in urine biomarker discovery[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 845: 43-58.

17 Hoefer IE, Steffens S, Ala-Korpela M., et al. Novel methodologies for biomarker discovery in atherosclerosis[J]. Eur Heart J, 2015, 36(39): 2635-2642.

18 Global Burden of Disease Cancer Collaboration, Fitzmaurice C, Dickerd D,et al. The Global Burden of Cancer 2013[J]. JAMA Oncol, 2015, 1(4): 505-527.

19 Zhu CQ, Shih W, Ling CH, et al. Immunohistochemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation[J]. J Clin Pathol, 2006, 59(8): 790-800.

20 National Lung Screening Trial Research Team, Aberle DR, Adams AM, et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening[J]. N Engl J Med, 2011, 365(5): 395-409.

21 Humphrey LL, Deffebach M, Pappas M, et al, Screening for lung cancer with low-dose computed tomography: a systematic review to update the US Preventive services task force recommendation[J]. Ann. Intern. Med, 2013, 159: 411-420.

22 Clark DJ, Fondrie WE, Yang A, et al. Triple SILAC quantitative proteornic analysis reveals differential ab undance of cell signaling proteins between normal and lung cancer-derived exosomes[J]. J Proteomics, 2016, 133: 161-169.

23 Yamashita T, Kamada H, Kanasaki S, et al. Epidermal growth factor receptor localized to exosome membranes as a possible biomarker for lung cancer diagnosis[J]. Pharmazie, 2013, 68(12): 969-973.

24 Huang SH, Li Y, Zhang J, et al. Epidermal growth factor receptor-containing exosomes induce tumor-specific regulatory T cells[J]. Cancer Invest, 2013, 31(5): 330-335.

25 孟祥宽. 血清外泌体膜蛋白GPC1在非小细胞肺癌筛查及预后评估中的应用价值[D]. 长春: 吉林大学, 2016.

26 Sandfeld-Paulsen B, Jakobsen KR, Bk R, et al. Exosomal proteins as diagnostic biomarkers in lung cancer[J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(10): 1701-1710.

27 Ueda K., Ishikawa N, Tatsuguchi A, et al. Antibody-coupled monolithic silica microtips for highthroughput molecular profiling of circulating exosomes[J]. Sci Rep, 2014, 4: 6232.

28 Park JO, Choi DY, Choi DS, et al. Identification and characterization of proteins isolated from microvesicles derived from humanlung cancer pleural effusions[J]. Proteomics, 2013, 13(14): 2125-2134.

29 Li Y, Zhang Y, Qiu F, et al. Proteomie identification of exosomal LRG1: A potential urinary biomarker for detecting NSCLC[J]. Elcctrophoresis, 2011, 32(15): 1976-1983.

30 Jakobsen KR., Paulsen BS, Bk R, et al. Exosomal proteins as potential diagnostic markers in advanced non-small cell lung carcinoma[J]. J Extracell Vesicles, 2015, 4: 26659.

31 Rolfo C, Chacartegui J, Giallombardo M, et al. Exosomes isolated in plasma of non-small cell lung cancer patients contain microRNArelated to the EGFR pathway: Proof of concept[J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(4 Suppl): S85.

32 Rodriguez M, Silva J, Lopez-Alfonso A, et al. Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2014, 53(9): 713-724.

33 Silva J, García V, Zaballos, et al. Vesicle-related microRNAs in plasma of nonsmall cell lung cancer patients and correlation with survival[J]. Eur Respir J, 2011, 37(3): 617-623.

34 Munagala R, Aqil F, Gupta RC. Exosomal miRNAs as biomarkers of recurrent lung cancer[J]. Tumour Biol, 2016, 37(8): 10703-10714.

35 Zhou X, Wen W, Shan X, et al. A six-microRNA panel in plasma was identified as a potential biomarker for lung adenocarcinoma diagnosis[J]. Oncotarget, 2017, 8(4): 6513-6525.

36 Taylor DD, Shah S. Methods of isolating extracellular vesicles impact downstream analyses of their cargoes[J]. Methods, 2015, 87: 3-10.

37 Hu J, Wang Z, Liao BY, et al. Human miR-1228 as a stable endogenous control for the quantification of circulating microRNAs in cancer patients[J]. Int J cancer, 2014, 135(5): 1187-1194.

38 Wang S, Zhang L, Wan S, et al. Aptasensor with expanded nucleotide using DNA nanotetrahedra for electrochemical detection of cancerous exosomes[J]. ACS Nano, 2017, 11(4): 3643-3949.

39 Xia Y, Liu M, Wang L, et al. A visible and colorimetric aptasensor based on DNA-capped single-walled carbon nanotubes for detection of exosomes[J]. Biosens Bioelectron, 2017, 92: 8-15.

40 Gholizadeh S, Shehata Draz M, Zarghooni M, et al. Microfluidic approaches for isolation, detection, and characterization of extracellular vesicles: Current status and future directions[J]. Biosens Bioelectron, 2017, 91: 588-605.