烟酰胺磷酸核糖转移酶在子宫内膜异位症中的表达及其与新生血管生成的相关性

罗迪 牛刚 梁炎春 吴锦杰 谢鸿玉 李佳颖

1东莞企石医院妇产科（广东东莞 523500）；2中山大学附属第一医院妇产科（广州 510080）；3中山大学中山医学院临床医学八年制2012级（广州 510080）；4中山大学中山医学院临床医学八年制2013级（广州510080）

子宫内膜异位症是妇科最常见的良性疾病之一，其发病机制尚未明确。内异症作为一种慢性炎症性疾病，其发病机制与新生血管密切相关，而且内异症病灶的发生发展与肿瘤的发生发展有类似之处，异位内膜组织亦具备类似肿瘤细胞的侵袭、增殖和转移等恶性生物学行为。烟酰胺磷酸核糖转移酶（NMAPT）是一种重要的炎症因子和促血管生成因子。它被证实在多种恶性肿瘤中表达升高，并且与肿瘤的预后相关，是一种重要的促癌因子。因此，NAMPT作为一种促炎症的致癌因子，也可能促进内异症新生血管形成参与其发病机制。目前国内外尚无NAMPT在内异症中的发生发展中的相关研究。本研究拟通过ELISA、免疫组化等方法检测NAMPT在卵巢子宫内膜异位囊肿中的表达，并分析其与内异症病灶新生血管生成之间的关系。本研究为内异症的机制研究提供新的研究思路和潜在治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 病例资料选择2016年1月1日至2016年12月31日之间在中山大学附属第一医院妇科住院并行腹腔镜手术治疗的单侧卵巢子宫内膜异位囊肿病例（实验组）以及行孕前腹腔镜下宫颈环扎手术治疗的宫颈功能不全病例（对照组）作为研究对象，收集患者基本临床资料。研究开始前已征得伦理委员会审批通过，并且与每一位患者签署知情同意书。排除标准：合并盆腔慢性炎症或其他慢性炎症性疾病等；同时合并子宫腺肌病者；同时合并免疫性疾病者；同时合并或未排除恶性疾病者；术前3个月应用GnRHa或其他激素类药物。入选标准如下：

1.1.1 实验组所有患者术后均经病理证实为子宫内膜异位症，分为2组：（1）卵巢子宫内膜异位囊肿组（Ovarian Endometrioma，OEM组，n=50）；（2）卵巢子宫内膜异位囊肿患者在位内膜组（Endometriosis，EM组，n=30）。

1.1.2 对照组对照组为同期行孕前腹腔镜下宫颈环扎手术治疗的宫颈功能不全患者（Non⁃Endo⁃metriosis，NEM组，n=30）。所有患者均经腹腔镜手术和术后病理排除子宫内膜异位症。

1.2 研究方法使用ELISA的方法检测子宫内膜异位症患者和非子宫内膜异位症血清中NAMPT和IL⁃6的水平并进行相互比较。采用免疫组织化学的方法，用CD34对微血管进行标记，在显微镜下观察，对视野中阳性染色的微血管进行计数，再根据视野的面积计算出微血管密度。

采用免疫组化的方法，检测NAMPT、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR⁃2）在组织中的表达。免疫组化结果的判定采用HSCORE法：在200倍高倍镜下，随机选取5个视野，每个视野下计数50个细胞。阳性染色为细胞浆内出现棕黄色颗粒，以i代表染色深浅，根据细胞着色的强弱分为4个等级：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。HSCORE=ΣPi（i+1）（i=0，1，2，3；Pi表示评分为 i的细胞比例）。组织切片染色后均由两位病理学医师双盲读片，取各视野平均值。

1.3 统计学方法使用SPSS 18.0统计版软件包进行数据分析和处理。各组患者一般资料采用两组间独立样本的t检验；蛋白的表达以及微血管密度采用非参数秩和检验（Mann⁃WhitneyU检验和Kruskal⁃Wallis检验）。实验数据以均数±标准差表示；数据的相关性分析采用spearman等级相关分析，相关系数以r表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料OEM组、EM组、NEM组之间的年龄、BMI、孕次和产次均无统计学差异（均P＞0.05），提示以上研究组的资料具有可比性。

2.2 内异症患者血清中NAMPT的表达水平OEM组中NAMPT的血清浓度比NEM组显著升高（P＜ 0.05）（表1）。

表1 OEM组和NEM组之间NAMPT的血清浓度比较Tab.1 Comparison of serum level of NAMPT between OEM group and NEM group x± s，ng/mL

2.3 异位病灶中NAMPT、VEGF和VEGFR⁃2的表达OEM组病灶中的NAMPT、VEGF、VEGFR⁃2的表达均显著高于EM组以及NEM组中的在位内膜（均P＜ 0.05）（表2）。

表2 异位病灶中NAMPT、VEGF和VEGFR⁃2的表达Tab.2 Expression of NAMPT，VEGF and VEGFR⁃2 in different tissues ±s

表2 异位病灶中NAMPT、VEGF和VEGFR⁃2的表达Tab.2 Expression of NAMPT，VEGF and VEGFR⁃2 in different tissues ±s

指标/HSCORE NAMPT VEGF VEGFR⁃2 OEM 358.42±39.24 372.33±48.35 349.28±32.95 EM 233.68±46.34 256.22±37.21 267.82±41.68 NEM 222.42±50.01 243.27±46.55 251.38±39.84 P值＜0.05＜0.05＜0.05

2.3 内异症患者血清NAMPT水平与病灶中微血管密度的关系OEM组病灶中CD34（+）的微血管密度（MVD）明显高于EM组、NEM组在位内膜（P＜ 0.05）（图1）。

为了进一步探讨NAMPT可以影响新生血管生成参与内异症的发病机制，本研究分析了NAMPT血清学水平与MVD之间的关系。结果发现，OEM组患者血清中NAMPT水平与病灶中MVD呈正相关，相关系数r值为0.81（P＜0.05）。

图1 CD34免疫组化染色阳性的微血管密度（MVD）在各组间的比较Fig.1 Comparison of CD34（+）microvessel density（MVD）between different groups

3 讨论

子宫内膜异位症是最常见的妇科疾病之一，有盆腔疼痛等相关症状或者合并不孕的育龄期女性中，其发生率可高达60%［1］。特别是近年来子宫内膜异位症导致的慢性疼痛以及不孕，使得妇科医师不得不重新思考它在妇科疾病中的重要性。鉴于其临床处理的复杂性，对于子宫内膜异位症的机制研究以及潜在的治疗靶点的开发变得尤为重要。关于子宫内膜异位症发病机制的理论很多，但仍存在很多争议。经血逆流、盆腔微环境的改变、免疫状态的失调、炎症反应等，是造成内异症的重要原因。因此，探寻异位的子宫内膜如何在宫腔外侵袭、增殖和迁移，从而定植和生长，具有非常重要的意义。

3.1 NAMPT与子宫内膜异位症新生血管生成之间的关系NAMPT是一种公认的促癌因子，它的其中一个重要的促癌机制就是促进肿瘤中的新生血管生成［2］。本研究发现，NAMPT在卵巢巧囊患者的血清学水平较非内异症患者血清学水平高，而且进一步病理学实验证实，它在异位病灶中的表达明显高于在位内膜（EM组或者NEM组），提示NAMPT可能参与内异症的发病机制。而且，NAMPT的升高伴随着VEGF以及VEGFR⁃2水平的升高，也伴随着病灶中新生微血管密度的升高，进一步提示NAMPT可能通过促进新生血管形成参与内异症的发生发展。

研究发现，NAMPT可以通过上调CCR⁃2（che⁃mokine receptor type 2）、CCL⁃2［chemokine（C⁃C motif）ligand 2］、FGF⁃2（fibroblast growth factor 2）、SIRT1（silent information regulator 1）的表达促进乳腺癌病灶中新生微小血管的形成［3-5］。进一步体外实验证实，在人脐静脉血管内皮细胞中加入游离的NAMPT，一方面可以促进血管内皮细胞的迁移能力，另一方面可以激活NF⁃κB，从而上调内皮细胞VEGF表达，最终增强细胞的增殖能力［6-7］。另外，也有学者发现胞外NAMPT在高糖状态下可以促进人主动脉血管内皮细胞的存活以及促进新生微小血管的形成［8］，该过程也在小鼠动物实验中得到了进一步的证实。

3.2 NAMPT可能通过调节炎症反应参与子宫内膜异位症新生血管生成的过程NAMPT与多种炎症性疾病密切相关，它已经成为炎性疾病的标记物之一。NAMPT与传统的细胞因子类似，但它同时起着免疫调节以及自分泌、旁分泌等作用。采用外周血单核细胞进行体外培养实验，加入游离NAMPT之后，约有50种炎症基因受到其调节从而释放大量的炎症因子［9］。NAMPT的血清学水平与循环中的炎性指标如IL⁃6、CRP（C反应蛋白）以及MCP⁃1（monocyte chemoattractant protein 1）成正相关［10-12］。受到炎症刺激后，NAMPT在多种细胞的表达明显上调，如LPS活化的单核细胞、TNF⁃α活化的胎盘上皮细胞、IL⁃1β活化的心肌细胞以及TLR⁃4和IL⁃6共同激活的皮脂腺细胞等［13］。局部微环境所造成的缺血、缺氧状态，进一步加剧了炎症反应，形成恶性循环。

内异症本身是一种慢性炎症性疾病，NAMPT作为一种重要的炎症因子，其在患者血清中以及病灶中的异常表达提示NAMPT可能参与内异症的发生发展。另外，研究结果显示NAMPT水平与病灶的微血管密度呈正相关。因此，NAMPT极有可能通过诱发和促进炎症反应而参与子宫内膜异位症的新生血管形成过程。

细胞外的NAMPT具有抗凋亡的作用，因此子宫内膜异位囊肿患者的血清学NMAPT水平的升高有利于促进巨噬细胞的存活。NAMPT可以促进巨噬细胞分泌IL⁃6，一方面促进胞内STAT3（sig⁃nal transducer and activator of transcription 3）的表达，另一方面可以其自身旁分泌、自分泌的过程，促进自身表达水平的提高［14］。

有学者提出，NAMPT可以促进血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的炎症反应，最终诱导新生血管形成。NAMPT直接作用于血管平滑肌细胞，通过ERK⁃1/2、NF⁃κB、iNOS信号通路轴诱发血管平滑肌的炎症反应，并且促进血管平滑肌细胞的增殖［15-16］。炎症相关性的转录因子如NF⁃κB、细胞粘附因子如ICMA⁃1（intercellular adhesion molecule 1）、VCAM⁃1（vascular cell adhesion molecule 1）和 E⁃selectin受NAMPT上调后可诱导单核细胞的迁移和募集，从而导致病灶中巨噬细胞的增多。另一方面，NAMPT可以促进IL⁃6的表达上调，促进单核细胞与血管内皮细胞的粘附，并逐渐越过血管屏障到达病灶，受NAMPT诱导更加可以分化成为M2型的巨噬细胞，加重炎症反应［14］。同样的，这种由内异症主导的“NAMPT-炎症-NAMPT”恶性循环，在病灶中不断加强，通过促进异位病灶中新生血管形成参与内异症的发生、发展。内异症病灶通过自分泌和旁分泌两条重要通路，上调NAMPT的表达，在炎症因子IL⁃6、炎症细胞巨噬细胞的作用下，通过上述途径促进病灶中新生毛细血管的生成，从而参与内异症的发生。

综上所述，NAMPT参与子宫内膜异位症新生血管生成过程的其中一个重要机制是激活和加强病灶微环境的炎症反应。至于NAMPT参与促进炎症反应的具体分子信号通路机制，NAMPT是否通过其他通路促进内异症病灶中的新生血管形成等，有待进一步的后续研究。

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