高效液相紫外色谱法分析酒精依赖标记物糖缺陷转铁蛋白

黄培培， 谢 辉， 米尔孜合买提·买买提明， 王世雯， 艾克拜尔·热合曼

(1新疆医科大学基础医学院法医教研室， 乌鲁木齐 830011； 2乌鲁木齐市第四人民医院戒酒科， 乌鲁木齐 830000)

饮酒过量已成为一个主要的全球公共卫生问题[1]，饮酒过量会导致永久性认知功能损害和脑结构改变[2]。临床上饮酒的常规指标包括血清谷氨酰转移酶(GGT)、血清天冬氨酸(AST)和丙氨酸转移酶(ALT)和红细胞平均体积(MCV)。这些指标由于受其它疾病、药物及肝功能的影响，其诊断特异性、灵敏度欠佳[3]。最新的生物标志物中，最重要的是糖缺陷转铁蛋白(CDT)。CDT是指糖基化程度较低的小品种转铁蛋白，包括无唾液酸转铁蛋白(PI=5.9)、单唾液酸转铁蛋白(PI=5.8)和二唾液酸转铁蛋白[4](PI=5.7)，分别包含0、1、2个唾液残基。通常认为每日摄入50～80 g酒精持续至少2 w后，CDT水平将升高[4]，并在禁酒一段时间后又会消失，半衰期约15 d[5]。Stibler等[6]在20世纪70年代末首次报道的CDT与酗酒关系密切。目前，国际上法医鉴定使用最广泛的间接标志物为糖缺陷转铁蛋(CDT)，被认为是具有较高灵敏度、特异性的指标[7-9]，临床上常用于监测酒精依赖病人的戒酒过程。

CDT的测量方法主要有高效液相法(HPLC)[7]、毛细管电泳法(CZE)[4,8]、等电聚焦法(IEF)、阴离子交换色谱法、散射比浊法[8]等。有文献报道在英国当CDT用于交通医学领域时，检测时仅使用HPLC方法作为唯一标准[10]。当前国内学者也纷纷开始重视研究CDT，部分医院检验科室开始试用毛细管电泳法进口Sebia试剂盒检测CDT。本课题组考虑到国内大部分实验室高效液相紫外(HPLC-UV)仪器普遍，选择使用高效液相进行CDT的检测。毛细管电泳法进口SebiaCDT试剂盒研究证实目前已拥有了良好的精密度、可靠性[4,8]，该方法可作为金标准，将HPLC-UV结果与其进行比较，进而评估高效液相诊断饮酒标志物CDT的有效性能。

1 仪器与材料

1.1仪器高效液相色谱仪(色谱仪：LC-20AB，SPD-20A紫外检测器，日本岛津公司)，高效液相色谱柱(阴离子交换柱：proteomix SAX-NP 5U,Sepax technologies，美国)，毛细管区带电泳Capillarys 2(Sebia，法国)，冰箱[11](FCD-217SE，海尔电冰柜)，低速大容量离心机[11](TDL-50B，上海安亭科学仪器厂)，三频数控超声波清洗器KQ-500VDB型[11](昆山市超声仪器有限公司)，AB135-S型电子分析天平[21](METTLERTOLEDD,瑞典)。

1.2材料Bis-Tris(CAS：6976-37-0，批号707B021，北京索莱宝科技有限公司)，硫酸葡聚糖(批号：109A039，北京索莱宝科技有限公司)，三氯化铁水溶液(30%，批号20160824，北京索莱宝科技有限公司)。Capillarys CDT试剂盒(Sebia公司)：CDT正常质控品(批号：23022/01)和高值质控品(批号：07062/01)、碱性缓冲液(批号：07055/80)、样品稀释液(批号：26055/01)、洗液(批号：01065/80)和CDT洗液(批号：06015/01)；质控条形码、稀释小杯、滤器、CDT清洗杯。超纯水(实验室自制)。一次性使用真空贮血管(赣达医疗器械有限公司)。氯化钙、碳酸氢钠、氯化钠均为分析纯。

2 方法

2.1样品采集与保存样品包括新疆乌鲁木齐市第四人民医院戒酒科提供的47份过量饮酒患者的静脉血样及新疆医科大学附属医院检验科提供的13份未饮酒者的静脉血样。

酒精进入体内后经肝脏代谢为各种形式的代谢物，在血液中检测到指标物CDT可作为长期饮酒的证据。采集的血样保存在不含抗凝剂的红色贮血管中，3 000 r/min离心5 min。离心后，取上层血清于离心管中，将血清保存在-20℃冰箱中，直至测量。

2.2储备液的配制

2.2.1 流动相A、B、C使用液的配制 流动相A：准确称取2.092 g Bis-Tris，然后置于1 L容量瓶中，用超纯水溶解，稀释至刻度后摇匀,此溶液浓度为10 mmol/L。流动相B：准确称取2.092 g Bis-Tris和14.61 g氯化钠，置于500 mL容量瓶中，用超纯水溶解，稀释至刻度后摇匀,此溶液浓度为20 mmol/L。流动相C：准确称取14.61 g氯化钠，然后置于500 mL容量瓶中，用超纯水溶解，稀释至刻度后摇匀,此溶液浓度为0.5 M。

2.2.2 其它使用液的配制 500 mmol/L碳酸氢钠溶液的配制：称取0.42 g碳酸氢钠，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至100 mL定容。10 mmol/L氯化铁溶液的配制：量取54.068 mL的30%的氯化铁溶液，置于10 mL的棕色容量瓶中，加水稀释至10 mL定容。100 g/L硫酸葡聚糖溶液的配制：称取1 g硫酸葡聚糖，置于10 mL的容量瓶中，加水稀释至10 mL定容。 1mmol/L氯化钙溶液的配制：称取11.1 mg氯化钙，置于100 mL容量瓶中，加水稀释至100 mL定容。

2.3样品预处理取1 mL血清样品，用25 mL碳酸氢钠(500 mmol/L)和18 mL氯化铁(10 mmol/L)使血样中的铁离子饱和；再用10 mL的硫酸葡聚糖(100 g/L)和50 mL的氯化钙(1 mmol/L)沉淀血清中的脂蛋白；该样品放置在4℃冰箱中30～60 min，取出混合液3 000 r/min离心5 min。将离心后的样品上清液置于冻存管中，用超纯水稀释10倍，将稀释样品经超声波排除气泡，用0.45 mm微孔滤膜过滤，送样品用高效液相色谱仪—紫外检测器进行测定。质控样品和空白样品同样依照此类方法处理，然后送样进行HPLC-UV检测。

2.4高效液相色谱法-紫外检测条件流动相A：10 mmol/L Bis-Tris，pH=6.2；流动相B：20 mmol/L Bis-Tris,0.5 M氯化钠,pH=6.2；流动相C：0.5 M氯化钠。流动相B浓度呈线性增加[12-13]，30 min从0%增加至27%,梯度洗脱程序如表1。检测波长设置460 nm。转铁蛋白异构体通过阴离子交换柱，经盐剃度洗脱分离。进样量:100 mL；柱温：40℃。转铁蛋白异构体根据电荷(等电点)不同而分离。样品注入和分开后，柱子使用流动相C 即0.5 M的氯化钠溶液冲洗重置。最后，在下一次梯度前用Bis-Tris缓冲液重新平衡系统。色谱柱为proteomix SAX-NP 5U(46×250 mm)；检测波长:460 nm；流速：1.0 mL/min。

表1 梯度洗脱程序

2.5毛细管电泳仪法检测条件在毛细管区带电泳系统中,毛细管电泳仪配备有8个毛细管，其中毛细管是定制的，17.5 cm×25 mm。CAPILLARYS CDT试剂盒包含CDT正常质控品(CDT值=0.8%)和高值质控品(CDT值=6.4%)、碱性缓冲液(pH=8.8)、样品稀释液、洗液和CDT洗液。毛细管电泳使用铁饱和溶液将血清中的所有转铁蛋白的异构体加以分离。转铁蛋白异构体在毛细管阴极端于200 nm处被检测[14-15]。使用pH缓冲液，转铁蛋白异构体以如下次序被检测到：无唾液酸转铁蛋白、二唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白、五唾液酸转铁蛋白。CDT值以无唾液酸转铁蛋白(当可以检测出时)和二唾液酸转铁蛋白峰面积之和(A0+A2)占无唾液酸转铁蛋白到五唾液酸转铁蛋白峰面积之和(A0+A2+A3+A4+A5)的百分比形式表达，即CDT=(A0+A2)/(A0+A2+A3+A4+A5)×100%。所有操作根据制作商提供的说明书的操作步骤完成。根据说明书内容，CDT值>1.6%为阳性，1.3%

2.6统计学方法应用SPSS21.0统计软件进行统计学分析，包括筛查诊断实验、直线回归分析。HPLC-UV法和CZE法两种方法的关系用Y=a+bx表示。

3 结果

3.1高效液相方法学考察

3.1.1 专属性实验 在HPLC-UV法实验条件中，血清中杂质不干扰样品峰，基线较稳定，转铁蛋白有明显的色谱峰和很好的分离度，二唾液酸转铁蛋白的保留时间约为15.35 min。图1为未饮酒者血清样品高效液相图。图2为饮酒者血清样品高效液相图。图1、图2中2、3、4、5分别指二、三、四、五唾液酸转铁蛋白。表2、表3分别对应图1、图2的CDT检测结果。图1未饮酒者血清样品CDT值为1.16%，图2饮酒者血清样品CDT值为7.03%。

3.1.2 重复性实验 取同一份血样制备5份待测样品，按“2.4”项，测定二、三、四、五唾液酸转铁蛋白，CDT值分别为5.30%、5.76%、5.10%、5.06%、5.50%，其平均值为5.344%，RSD为5.451%。

3.1.3 精密度实验 准备低、中、高浓度的CDT血清样品，待处理好后3种样品分别连续进样5次，每次进样量100 mL，按“2.4”项条件进行检测，测得CDT值，其RSD值为1.906%～8.518%，见表4。

表2 HPLC法未饮酒者血清CDT检测结果值

表3 HPLC法饮酒者血清CDT检测结果值

图1 未饮酒者血清样品高效液相图

图2 饮酒者血清样品高效液相图

序号CDT值平均值RSD11.081.1468.5181.11.271.231.0524.554.5363.3604.634.54.74.338.99.1901.9069.39.159.329.28

3.1.4 稳定性实验 取饮酒者的待测血样，将处理好的稳定性样品放置于冰箱冷藏室，分别于第0、6、12、24、48 h测定该样品的CDT含量，考察样品放置的稳定性，CDT值分别为3.00%、2.94%、3.20%、3.50%、3.30%，计算其平均值为3.188%,RSD为7.134%,样品在48 h内稳定。

3.1.5 准确度实验 取高值质控品(CDT=6.4%)，按“2.3”项步骤处理好样品，重复测定5次，CDT值分别为7.33%、6.79%、6.91%、6.63%、7.21%，计算其平均值为6.974%,相对误差为5.750%，RSD为4.172%，表明准确度较好。

3.2高效液相结果做出受试者工作特征(ROC)曲线(图3)，由此确定CDT值>1.9%为阳性，CDT值≤1.9%为阴性。

3.3HPLC-UV法和CZE法所测结果的比较以毛细管电泳法作为测量CDT值的金标准，高效液相作为诊断实验，2种方法判定结果如表5。由表5计算可知，灵敏度为95.7%，特异性为92.3%，假阴性率为4.255%，假阳性率为7.692%。Youden指数r=88%。粗符合率为95%[(45+12)/60]。调整一致性(AA)为93.88%。Kappa值为85.7%，>75%。2种方法具有较好的一致性。

图3 根据高效液相法作CDT的受试者工作特征曲线

3.4HPLC-UV法和CZE法测量CDT值的相关性2种检测CDT的方法测得的CDT值之间的关系如图4所示，HPLC-UV法与参考方法毛细管电泳法(CZE)间具有良好的线性关系，回归方程为Y=0.896 8X+0.691 3，R2=0.935 1。2种CDT测量方法截止值不同(1.9 vs 1.6)，检测60份样品获得的CDT值是高度相关的，它们的平均偏差为(0.11±1.26)%。

表5 2种方法检测CDT的结果/例

图4 CZE法和HPLC法所测CDT值相关性分布图

考虑(0.11±2.52)%作为一个可接受范围，只有3个样品在可接受范围外，如图5：2种实验所测这3个样品均呈现阳性，其中2个样品CZE法所测值较高(CZE:13.5；HPLC：9.2)(CZE:18.1;HPLC：15.07)，另外一个样品HPLC-UV所测值较高(HPLC：7.82；CZE:4.6)。从图中可以看出，在一致性范围内，差值的平均值为0.11，差值的绝对值最大值为4.3(图中空心圆圈代表的点)。2种方法的差异在误差范围内，是可被临床和司法鉴定接受的。

图5 HPLC法和CZE法测量CDT的Bland-Altman图

4 讨论

本研究证实检测CDT的HPLC-UV目前已拥有了良好的灵敏度(95.7%)和特异性(92.3%)，并且与金标准毛细管电泳法(CZE)间具有良好的良好的线性关系，回归方程为Y=0.896 8X+0.691 3，R2=0.935 18。转铁蛋白指标的优势已经被讨论[7]。HPLC-UV的程序自动给出计算的CDT百分比。该技术结果可以重现。高效液相色谱法的另一个优点是在特殊的460 nm波长吸收处提供文档证据，这对检测转铁蛋白的遗传变异是有帮助的[12-13]。饮酒者的血样是脂血，一些脂蛋白和其他血清蛋白在pH 6.2处沉淀，引起柱压梯度增加。所以，在操作时应该注意柱子的再生和系统的平衡。人群中确认存在38种转铁蛋白的遗传变异[8,16]。其中，大部分遗传变异类型为等电点有微小改变的C型，其不干扰色谱模式。只有1‰～2‰加拿大人口的最阳极形式的转铁蛋白BC杂合子和转铁蛋白CD杂合子色谱轮廓会受干扰。在检测CDT的案例中，当HPLC-UV检测是基于铁转蛋白-铁离子复合物的紫外选择吸收时，建议将毛细管电泳分析作为一个验证实验。

检测人群不同，CDT的灵敏度和特异性会发生变化。据Stibler等[6]所述，以往所用的方法均达到82%的灵敏度和97%的特异性。CDT是酒精依赖诊断的一个间接的标记物，其诊断性能远远优于其他现有的生物标记物[17]。

本研究考虑到国内大部分实验室HPLC仪器普遍，选择使用HPLC-UV进行CDT的检测。对血清进行前处理使铁离子饱和和脂蛋白沉淀，建立了一种基于proteomix SAX-NP 5U 色谱柱，利用HPLC-UV对血清中的CDT进行检测的方法。综上所述，HPLC-UV检测CDT有较高的灵敏度和特异性，方法简便，可定性定量，对于法医司法鉴定和临床酒精依赖的诊断和治疗监控有较高的应用价值。

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