巨噬细胞移动抑制因子在唾液腺腺样囊性癌中的表达及临床意义

胡露露， 龚忠诚， 陈青立， 李晨曦， 田忠奇， 尹小朋， 马 亮， 牛雅琪， 王成刚， 刘 慧

(新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科, 乌鲁木齐 830054)

早在1853年和1854年，3位法国学者(Robin，Lorain，Laboulbene)就分别在两篇文献中描述了腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)“圆柱型”表现的病理学特点，该肿瘤起源于闰管储备细胞，是唾液腺上皮源性恶性肿瘤的常见类型。虽较其他类型头颈部肿瘤发病率偏低，但因其恶性程度高、早期远处转移、局部复发率高、嗜神经性生长、带瘤存活时间较长、治疗效果不理想等临床特点备受关注。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是Bloom等[1]在1966年发现，因可抑制巨噬细胞的迁移而得名。近年的研究表明，MIF除了参与机体的免疫及炎症反应外，还在肿瘤的发生发展、转移预后等方面发挥了重要的生物学作用[2-5]，但MIF与腺样囊性癌的相关性研究鲜有报道。

本研究检测MIF在唾液腺腺样囊性癌组织中的免疫组化表达情况，探讨其在唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)发病中的意义，为SACC的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1研究对象收集2005年1月-2016年12月新疆医科大学第一附属医院收治并行手术切除经病理诊断确诊的腺样囊性癌病例，共51例。所有患者临床病理资料及术后随访资料完整，均随访至2017年3月31日。男性25例，女性26例，患者年龄31～81岁，中位年龄53.6岁，发病部位分别为：磨牙后腺(5例，9.80%)，舌下腺(13例，25.49%)，腮腺(16例，31.37%)，颌下腺(3例，5.88%)，鼻腔(1例，1.96%)，腭腺(10例，19.60%)，上颌窦及筛窦(1例，1.96%)，其他部位(2例，3.92%)。选取20例正常腮腺组织(normal salivary gland, NSG)标本作为对照，5例舌鳞状细胞癌组织标本作为阳性对照。

以2005年世界卫生组织(WHO)关于SACC的组织病理学分类标准行肿瘤病理分级、分类。病理分型结果：51例腺样囊性癌组织标本中，筛孔型21例，管状型17例，实体型13例。组织学分级结果：Ⅰ级：肿瘤中主要为管状型和(或)筛孔型而无实体型的，10例；Ⅱ级：肿瘤中存在管状型和(或)筛孔型，实体型成分≤30%，9例；Ⅲ级：肿瘤中管状型和筛孔型较少见，以实体型为主(实体部分>30%时即应为实体型)，32例。

1.2主要试剂兔抗人MIF单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，免疫组织化学法检测试剂盒(福州迈新生物技术有限公司显色试剂盒)。

1.3免疫组织化学染色所有标本经4%的福尔马林固定过夜，梯度乙醇脱水后石蜡包埋并切片，组织切片厚度4 μm。SP二步法行免疫组化染色。兔抗人MIF多克隆抗体一抗工作浓度1∶200，加一抗前，柠檬酸缓冲液( 0.01 mol/ L ，pH 6.0) 高温高压修复抗原1 min。DAB显色，苏木精复染细胞核。盐酸乙醇分化，自来水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验阴性对照组为PBS替代一抗。以舌鳞状细胞癌组织切片中的MIF表达作为阳性对照。

1.4结果判定由2位病理医生阅片并判定，细胞胞浆出现棕黄色时定性为MIF阳性表达细胞。判定阳性表达依据如下：(1)阳性细胞百分比：光镜(×400)下随机选取5个视野，每个视野中平均计数100个细胞。阳性细胞数5%以内，计0分；阳性细胞数6%～25%，计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分。(2)再根据阳性着色强度依次计0、1、2、3分(基本不着色为0分，黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分)。每张切片进行两项分数累计[6]，1～5分为低表达，6～7分为高表达。

1.5随访及预后通过电话或临床随访患者治疗后生存情况，以诊断日期为随访开始日期，2017年3月31日为末次随访截止时间。对于可疑复发或转移患者进行进一步临床检查，以病理结果及影像学诊断为复发或转移依据。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0软件处理数据，计数资料使用卡方检验，等级资料使用秩和检验，单因素生存分析使用Kaplan-Meier法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1MIF在腺样囊性癌中的表达MIF的免疫组织化学结果显示：51例唾液腺腺样囊性癌组织中均检测到MIF的阳性过表达，定位于细胞胞浆中，偶可见细胞膜及细胞核的阳性染色，呈中度至强阳性表达(图1)，MIF表达平均评分为(5.490±1.667)分。3种病理学类型(实体型、筛孔型、管状型)的MIF表达差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。与NSG相比较，SACC组织MIF表达较NSG组织高(P<0.05)(表2)。

A:SACC实体型(solid)

B:SACC筛孔型(cribriform)

C:SACC管状型(tubular)

D:NSG正常腮组织

E:SCC舌鳞状细胞癌组织

图1 MIF在唾液腺腺样囊性癌、正常腮腺组织及舌癌中的表达情况(×400)

表2 MIF在SACC组织与正常唾液腺组织中的表达/例

2.2MIF的表达与腺样囊性癌临床病理特征之间的关系MIF的表达程度与SACC的病理分型、年龄、性别等无明显相关性。但与SACC TNM临床分期、肿瘤大小、远处转移或复发及因病死亡等不良转归有关(表3)。

2.3生存率分析51例患者平均随访时间为40.59个月(2～100个月)，18例患者死于本病，33例患者仍然存活。Kaplan-Meier法分析结果表明，MIF高表达患者较MIF表达相对较低患者出现因病死亡，或者出现局部复发及转移可能性高(P<0.05),而MIF低表达组SACC患者的生存率较MIF高表达组生存率高(图2、3)。

3 讨论

腺样囊性癌可发生于任何年龄段(1～90岁)，中年及中年以上患者多见。SACC临床发展较为缓慢，病程较长，肿物无包膜，浸润性强，极易侵袭其周围的神经并循神经扩散。SACC远处转移发生率较高，甚至早期发生，常见肺部转移，术后极易复发，治疗棘手，目前临床以手术为主联合放化疗作为治疗的主要手段。控制肿瘤复发和远处转移是临床治疗中的首要关键问题。

表3 MIF的表达与腺样囊性癌临床病理特征/例

各类细胞因子在恶性肿瘤的发生与发展中发挥了复杂多样的作用。近年来，越来越多的研究表明MIF参与并影响了多种肿瘤的发生、发展。MIF基因定位于人22号染色体长臂1区1带2号亚带，相对分子质量为12.5 kDa。在正常的生理情况下，MIF呈组成性表达，主要来源于免疫细胞。不断有研究发现MIF在多种恶性肿瘤的细胞中，如胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、脑胶质瘤、皮肤癌、肺癌、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤中的表达明显升高，且在肿瘤的不同临床分期及分型中均可检测到MIF的差异过表达，提示MIF可能与肿瘤的细胞分化、增殖等过程有关。也有研究表明，MIF的过表达可促进肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞生长因子、细胞因子的分泌，并与肿瘤的侵袭性、转移潜能及疾病预后密切相关。Wilson等[7]发现外源性MIF浓度增加，可促进肿瘤细胞生长并阻止细胞凋亡；He等[8]认为MIF与胃癌的形成有关，并考虑作为监测胃癌的特异标志性蛋白；Meyersiegler等[9]通过影响MIF受体CD74的表达，来阻滞MIF的信号传导通路从而阻止前列腺癌的扩散；Xu等[10]发现，乳腺癌组织中MIF与IL-8和VEGF过度表达呈正相关，并和乳腺癌的血管再生联系密切。

图2Kaplan-Meier法分析MIF不同表达情况下SACC患者的转移及复发率

图3Kaplan-Meier法分析MIF不同表达情况下SACC患者的生存率

尽管MIF在各类疾病中的研究内容较为丰富，但我们发现尚未有明确的MIF与腺样囊性癌相关性研究的报告。MIF在腺样囊性癌组织中是否有差异表达？MIF对腺样囊性癌的发生发展是否发挥生物学作用？假使MIF对腺样囊性癌的发生发展有影响，那么作用机制又是如何？上述疑问是本研究的兴趣所在。

本实验我们利用免疫组化的方法明确MIF在SACC组织中的表达状态。本实验结果显示：纳入的51例SACC肿瘤组织标本中，均检测到MIF过表达，且主要表达于肿瘤细胞胞浆中，呈中至重度染色；NSG可见MIF的弱阳性表达，但在SACC组织中，MIF的阳性表达率显著高于NSG， 差异有统计学意义(P<0.05)。本研究结果显示，MIF的表达状态和腺样囊性癌的病理学分型间无明显相关性，我们推测此现象可能是由于本研究所纳入样本量有限所致。MIF与腺样囊性癌患者病理分级有关，病理分级与MIF表达呈正相关。

此外，本研究发现MIF阳性高表达组的患者总体存活率比MIF阳性低表达组更低。这一结果提示MIF在腺样囊性癌的发生、发展中可能发挥生物学作用。本研究中纳入的51例病例，经随访后发现20例出现了远处转移灶，经过统计学分析，腺样囊性癌转移病例组织中的MIF表达较非转移病例明显增高(P<0.05)。本研究结果提示MIF表达状态与腺样囊性癌患者预后有关，MIF高表达的患者发生因病死亡或者发生复发及远处转移大的可能性更大。我们推测，MIF可促进SACC肿瘤细胞的迁移及侵袭能力以促进腺样囊性癌的发展及侵袭，但MIF是通过何种途径在腺样囊性癌发展过程中发挥作用尚不明确。有研究指出，MIF可能是上调了肿瘤细胞的金属基质蛋白酶的表达，降解细胞外基质，以促进肿瘤细胞的侵袭性和转移能力。因此，本研究需进一步研究MIF在ACC发生、发展中的作用机制。

参考文献：

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