一株凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)发酵培养基的优化

董佩佩,汪祥燕,刘元香,辛国芹*,徐海燕,谷 巍,郑军红,陈梅楠

(1.山东宝来利来生物工程股份有限公司,山东 泰安 271000；2.山东省泰安市植物保护站,山东 泰安 271000)

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)是一类可以形成芽孢同时又产乳酸的细菌［1］,其除了具有一般乳酸菌的产酸、可调节动物肠道健康、提高消化能力和提高免疫力的益生性能外［2］,还具有芽孢菌耐高温、耐胆盐、耐酸等抗逆性［3-5］,被美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)和美国饲料控制官员协会列入可用于饲料的安全微生物菌种名单［6］,广泛地应用于医药［7］、畜禽［8-10］和水产［11-12］等行业。芽孢无新陈代谢,能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等,所以该芽孢杆菌制成的菌剂是较为理想的微生物制剂［13］。由于最终制成的菌剂要有芽孢的形式才具有高抗性,所以如何获得高活性高浓度的芽孢是制约凝结芽孢杆菌制剂生产的关键因素［14］,且发酵凝结芽孢杆菌的培养基配方又是进行后续生产的重要条件。

目前,对于凝结芽孢杆菌的研究重点在于如何用低廉易获得的培养基获得高浓度的凝结芽孢杆菌芽孢。路程等［15］对凝结芽孢杆菌T50进行产芽孢条件优化,确定培养基组成为蛋白胨2%,葡萄糖0.2%,酵母浸粉0.3%,麸皮5%；培养基初始pH 7.0,接种量2%,培养时间3 d,最终使芽孢形成率达到94.3%,但对发酵终点活菌数没有体现。吴逸飞等［16］对一株凝结芽孢杆菌的培养基原料及接种量、通气量等培养条件进行优化,最终获得芽孢数为3.5×108CFU/mL。孙丽娜等［17］通过发酵罐分批补料的方式得到凝结芽孢杆菌13002发酵终点活菌总数为3.095×109CFU/mL,最终冻干后达0.730×1011CFU/g。培养时间长,不易产孢,培养基及后处理工艺成本较高是制约凝结芽孢杆菌规模化生产的主要原因。

因此,该研究通过单因素试验对菌株碳氮源及无机盐进行筛选,Plackett-Burman(PB)试验对影响因子进行考察和评价,然后对关键影响因素进行最陡爬路径试验,进一步采用响应面法研究和探讨其交互作用,获得最佳发酵培养基组成,为其产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)(菌种保藏号BLCC1-0517)：山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

斜面培养基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化钠5 g/L,琼脂15 g/L,pH 7.0,121℃灭菌20 min。

种子培养基［18］：葡萄糖2 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化钠5 g/L,pH 7.0,121℃灭菌20 min。

基础发酵培养基［19］：可溶性淀粉10 g/L,豆粕5 g/L,硫酸锰0.34 g/L,pH 7.0,121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D超净工作台：江苏通净净化设备有限公司；GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；THZ-C恒温振荡器：扬州培英实验仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；OLYMPUSCX31型显微镜：日本奥林巴斯株式会社；DPH-9082电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵方法及培养条件

菌种活化：将实验室保藏的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)用斜面培养基活化,恒温培养箱中42℃培养48h。

种子培养：将活化好的凝结芽孢杆菌(B.coagulans)接种到种子液体培养基中,于42℃、180 r/min条件下摇床培养24 h,获得液体种子。

发酵培养：向基础发酵培养基中接入2%的种子液,于42℃、180 r/min条件下摇床培养48 h。

1.3.2 菌体数及芽孢数检测

菌体数测定：发酵液取样,用无菌生理盐水进行梯度稀释,倾注法检测含菌量,重复3次。

芽孢数测定：取5 mL发酵液,80℃水浴热处理10 min,用无菌生理盐水进行梯度稀释,倾注法检测芽孢的形成量,重复3次。

1.3.3 培养基优化单因素试验

碳源的确定：将基础发酵培养基中碳源分别用玉米淀粉、玉米面、麸皮、麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、低聚异麦芽糖、可溶性淀粉替换,添加量为1.0%,其他成分不变。接种量为2%,装液量为10%,置于42℃、180r/min条件下培养48 h,检测发酵液中的芽孢数,考察不同的碳源对菌株芽孢的形成量的影响。

氮源的确定：将基础发酵培养基中氮源分别用豆粕、蛋白胨、尿素、酵母膏、牛肉膏替换,添加量为0.5%,其他成分不变。接种量为2%,装液量为10%,置于42℃、180 r/min条件下培养48 h,检测发酵液中的芽孢数,考察不同的氮源对菌株芽孢的形成量的影响。

无机盐的确定：去掉基础发酵培养基中的无机盐,分别添加0.002 mol/L硫酸锰、硫酸镁、氯化钠、三氯化铁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、碳酸钙和硝酸钠,以不加任何无机盐的发酵培养基作对照,其他成分不变。接种量为2%,装液量为10%,置于42℃、180 r/min条件下培养48 h,检测发酵液中的芽孢数,考察不同的无机盐对菌株芽孢的形成量的影响。

1.3.4 培养基优化响应面试验

(1)Plackett-Burman试验设计

根据碳氮源单因素筛选试验及无机盐单因素试验结果,采用N=12的Plackett-Burman(PB)设计,把每个因素设计成高(+1)和低(-1)2个水平,对凝结芽孢杆菌发酵液中的芽孢数进行响应。根据单因素试验结果,确定麸皮(A)、牛肉膏(B)、硫酸镁(C)、硫酸锰(D)、磷酸二氢钠(E)这5个因素为PB试验的考察对象。根据PB试验设计方案配制培养基,接种量为2%,装液量为10%,置于42℃、180 r/min条件下培养48 h。PB试验因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

(2)最陡爬坡试验设计

根据Plackett-Burman试验结果各显著影响因素效应的大小设定步长及变化方向,以快速逼近最佳区域。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小确定,正效应的因素均取较高值,负效应的因素均取较低值。

(3)响应面分析试验方法

根据最陡爬坡试验结果,显著因素以中心点为零水平,高水平和低水平分别比零水平高于或低于一个实际步长。采用Design Expert version 8.0.5软件中心组合试验设计(central compositedesign,CCD)进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响

图1 不同碳源对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响Fig.1 Effects of different carbon sources on the spore number of B.coagulans

不同碳源对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响见图1。由图1可知,麸皮作为唯一碳源时,发酵液中的芽孢数最多,达到1.03×108CFU/mL,其次是低聚异麦芽糖,芽孢数为8.53×107CFU/mL。葡萄糖作为单一碳源时,芽孢最少,芽孢数为5.01×106CFU/mL。综合成本及芽孢数情况,选择麸皮为后续研究的碳源。

2.2 不同氮源对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响

不同氮源对芽孢数的影响见图2。由图2可知,牛肉膏作为氮源时发酵液中芽孢数最高,为1.01×108CFU/mL,其次是豆粕,发酵液芽孢数为8.86×107CFU/mL。蛋白胨和尿素作为氮源时,芽孢数较少,分别为2.23×107CFU/mL和1.17×107CFU/mL。所以选择牛肉膏作为后续试验的氮源。

图2 不同氮源对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources on the spore number of B.coagulans

2.3 不同无机盐对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响

不同无机盐对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响结果见图3。由图3可知,添加硫酸锰、硫酸镁和磷酸二氢钠时,发酵液芽孢数分别为9.70×107CFU/mL、1.19×108CFU/mL、8.93×107CFU/mL,均高于对照组芽孢数5.80×107CFU/mL。所以选择硫酸锰、硫酸镁和磷酸二氢钠作为无机盐。

图3 不同无机盐对凝结芽孢杆菌芽孢数的影响Fig.3 Effects of different inorganic salts on the spore number of B.coagulans

2.4 Plackett-Burman试验结果

按PB试验设计进行试验,把每个因素设计成高(+1)和低(-1)2个水平,高水平是低水平的1.5倍。PB试验设计及响应值结果见表2,各因素水平及显著性分析见表3。

表2 PB试验设计及结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3分析结果可知,麸皮和牛肉膏为正效应,硫酸镁、硫酸锰、磷酸二氢钠为负效应。从P值来看,可信度＞95%的因素为麸皮和牛肉膏,影响显著(P＜0.05)；其他因素在α=0.05水平上对芽孢数影响不显著(P＞0.05)。确定麸皮和牛肉膏作为主要影响因素进行下一步试验。

表3 Plackett-Burman试验因素效应分析Table 3 Effect analysis of factors of Plackett-Burman experiments

2.5 最陡爬坡试验

根据表3分析结果,显著因素的变化步长及方向的试验设计及结果见表4。

表4 最陡爬坡试验设计及结果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

由表4可知,第3组试验麸皮30.0 g/L,牛肉膏15 g/L时凝结芽孢杆菌发酵液中芽孢数最高,为25.65×107CFU/mL。故采用麸皮30.0 g/L,牛肉膏15.0 g/L为后续响应面试验的中心点。

2.6 响应面分析的试验设计及结果

根据最陡爬坡试验确定了重要影响因素的取值区间。利用Design Expert version 8.0.5进行中心组合的试验设计,对凝结芽孢杆菌培养基中的关键因素做进一步的研究和探讨。以麸皮和牛肉膏为自变量,以凝结芽孢杆菌芽孢数(Y)为响应值,进行2因素5水平的中心复合设计试验,试验因素与水平见表5,设计及结果见表6,回归模型方差分析结果见表7。

表5 中心组合试验设计因素与水平Table 5 Factors and levels of central composite experiments design

表6 中心组合试验设计及结果Table 6 Design and results of central composite experiments

表7 回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根据表6试验结果通过Design-Expert软件进行响应面分析,建立多元二次回归方程如下：Y=31.68+2.64A+0.47B+1.32AB-12.69A2-13.05B2

由表7可知,模型P=0.016 1＜0.05,表明模型对响应值Y的影响显著,可信度较高；模型的二次项对凝结芽孢杆菌芽孢数的效应影响极显著(P＜0.01)；模型失拟项的P值为0.910 2,影响不显著(P＞0.05),表明多元回归方程具有显著性,模型能对凝结芽孢杆菌产芽孢数进行较好的分析和预测。

2.7 最适培养基组成的确定及验证试验

根据上述回归方程绘出响应面分析图,以确认麸皮和牛肉膏对凝结芽孢杆菌产芽孢数的影响,响应面图见图4。

图4 麸皮与牛肉膏交互作用对芽孢数影响的响应面和等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between bran and beef extract on spore number

由图4可知,该方程的抛物线图形开口向下,说明方程存在最大值,即响应面范围覆盖了最大值所在的区域。由Design Expert version 8.0.5软件分析得到最适培养基中麸皮和牛肉膏对应的实际值分别为32.12g/L和15.24g/L。由此可知,最适培养基组成为麸皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸镁0.49 g/L,硫酸锰0.34 g/L,磷酸二氢钠0.31 g/L。预测在此组成条件下发酵凝结芽孢杆菌(B.coagulans)芽孢数最高,理论值为3.18×108CFU/mL。

使用最优培养基进行凝结芽孢杆菌(B.coagulans)验证试验,实际芽孢数为3.38×108CFU/mL,略高于预测结果,说明响应面优化试验结果可靠。

3 结论

经过单因素试验与响应面设计分析,确定凝结芽孢杆菌(B.coagulans)的最优发酵培养基配方为麸皮32.12 g/L,牛肉膏15.24 g/L,硫酸镁0.49 g/L,硫酸锰0.34 g/L,磷酸二氢钠0.31 g/L。在此配方条件下发酵凝结芽孢杆菌,芽孢数达到3.38×108CFU/mL,是优化前的5.28倍。

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