白酒生产用己酸菌发酵液发酵条件及培养基组成的优化

胡智慧,谌柄旭,任 雪,郭学武,肖冬光*

(天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室,天津 300457)

浓香型白酒是目前我国产量最大、消费面最广、研究最多的一类白酒,其质量的好坏与窖泥的质量关系密切［1］。窖泥是己酸菌生长、繁殖和代谢产己酸的场所,所产己酸在大曲酯化酶的作用下与乙醇发生酯化反应,形成浓香型白酒的主体香成分—己酸乙酯,其含量影响着浓香型白酒的风格与质量。

窖泥经过一段时间的使用后,就会出现退化现象,如表面析出浅白色或针状结晶物质,致使浓香型白酒中的己酸乙酯含量降低,严重影响白酒的风味及口感［2］。目前科研工作者已采取使用超浓缩复合己酸菌液［3-5］、固(液)窖泥功能菌［6-9］、人工窖泥［10-13］等多种方法修复老化窖泥,来弥补窖泥退化带来的不良后果。

浓香型白酒的生产多使用小窖池作为发酵容器,虽然酒的品质好,但很大程度上限制了糟醅出入窖池的方式,降低了劳动效率,增加了劳动强度及生产成本,给浓香型白酒的机械化生产带来了很多的困难。随着大窖池和机械抓斗的应用,极大地提高了劳动效率,但同时也影响了白酒的品质,主要是因为大窖池窖泥中的己酸菌所产的己酸很难渗透到窖池中部,致使窖池中部很难形成己酸乙酯。高浓度己酸菌发酵液的灌窖可以有效地解决大窖池中部己酸乙酯合成不足的问题,进而改善和提高白酒的品质。

己酸菌发酵液已广泛应用于浓香型白酒的生产中,如可以应用于浓香型白酒的灌窖［14-15］,增加窖池中己酸的浓度,为己酸乙酯的合成提供充足的前体物；也可以用于窖池保养［15-16］、人工窖泥培养［17］,修复改善窖泥微生态菌群,增加窖泥的活力；还可以应用于浓香型白酒的酯化液制作［18-19］,直接添加到窖池中或者串蒸酒醅,达到提高浓香型白酒中己酸乙酯含量的目的。如何快速地提高己酸菌发酵液中己酸的含量,满足浓香型白酒生产的需求,节约生产成本,是亟需解决的问题之一。本研究采用单因素试验和响应面法对影响己酸菌代谢产酸的发酵条件和培养基组成进行了优化,旨在探索出己酸菌发酵液的最佳生产工艺,为其工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

己酸菌：从浓香型白酒的窖泥中筛选得到；硫酸铵、磷酸氢二钾、乙醇：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙酸钠、碳酸钙、硫酸镁：天津市化学试剂一厂；酵母浸粉(生化试剂)：北京奥博星生物技术公司；生物素：北京索莱宝科技有限公司；对氨基苯甲酸：上海麦克林生化科技有限公司；以上试剂均为分析纯；己酸标准品(色谱纯)：美国Sigma-Aldrich公司。

种子培养基［20］：乙酸钠0.5g/100mL,硫酸铵0.05g/100mL,磷酸氢二钾0.04 g/100 mL,硫酸镁0.02 g/100 mL,酵母浸粉0.2 g/100mL,自然值pH,121℃灭菌20 min。干热灭菌后接种前加入1g/100mL碳酸钙,过滤除菌后加入2.5mL/100mL体积分数95%乙醇溶液。

发酵培养基：乙酸钠0.5g/100mL,硫酸铵0.05g/100mL,磷酸氢二钾0.04 g/100mL,硫酸镁0.02 g/100 mL,酵母浸粉0.2g/100mL,自然pH值,121℃灭菌20 min。干热灭菌后接种前加入1g/100 mL碳酸钙,过滤除菌后加入0.05 g/100mL对氨基苯甲酸、0.05 g/100 mL生物素和2.5 mL/100 mL体积分数95%乙醇溶液。

1.2 仪器与设备

LRh-250A型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪：美国Agilent公司；UV-1200紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 己酸菌种子培养周期的确定

取100μL己酸菌接入含有5 mL种子培养基的试管中,35℃,200 r/min活化培养12 h。活化种子液按10%的接种量接入装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,35℃、200 r/min培养36 h,每2 h在波长600 nm处测定发酵液吸光度值OD600nm,记录己酸菌生长情况,绘制己酸菌的生长曲线。

1.3.2 己酸菌发酵条件优化

采用单因素优化法,以己酸产量为评价指标,分别对发酵温度(30℃、33℃、35℃、37℃、40℃)、发酵时间(3 d、7d、11 d、15 d、20 d)、接种量(3%、5%、10%、15%、20%)、装液量(25mL/100mL、50mL/100mL、75mL/100mL、100mL/100mL、125 mL/100 mL)进行优化,于恒温培养箱静置培养,培养基为发酵基础培养基。

1.3.3 己酸菌发酵培养基优化

在己酸菌发酵条件优化的基础上,采用Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心组合设计、响应面法对己酸菌发酵培养基的组成进行优化,确定己酸菌发酵液的最佳生产工艺。

(1)Plackett-Burman试验设计

采用Minitab17软件创建Plackett-Burman试验,选取发酵基础培养基的9个组分作为筛选对象,筛选出对己酸产量影响显著的因素,每个因素取2个水平,高水平是低水平的1.5倍。选用变量个数N=20的Plackett-Burman设计表,另加3个空白项(虚拟变量),用于考察试验误差。Plackett-Burman试验因素与水平见表1。

表1 Plaekett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

(2)最陡爬坡试验设计

根据Plackett-Burman试验结果,选取乙酸钠、硫酸铵、生物素3个对己酸产量影响显著的因素,以试验值的正负效应确定爬坡方向,根据各因素效应值与比例来确定变化步长,梯度增加或者减少试验值,对产酸影响不显著的其他因素均取平均水平。

(3)中心组合设计

在Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验结果的基础上,利用Minitab17软件创建中心组合设计,进一步对发酵培养基的组成进行优化。以乙酸钠(X1)、硫酸铵(X2)、生物素(X3)3个因素作为考察因素,己酸产量(Y)为响应值,每个因素取5个水平,共有20个试验点,其中有15个析因点和5个中心点,中心组合设计因素与水平见表2。

表2 中心复合试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of center composite experiments design

1.3.4 己酸产量的检测方法

采用高效液相色谱法测定己酸产量。色谱条件：色谱柱：Aminex HPX-87H有机酸色谱柱(300 mm×7.8 mm,9μm),流动相：5 mmol/L的H2SO4溶液,流速：0.6 mL/min,紫外检测波长：210 nm,柱温：65℃,进样量：20μL。

1.3.5 数据处理

每组试验重复3次,数据均以平均值表示。采用OriginPro 8.5.1绘制图表,Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心复合试验、响应面试验的设计与分析均采用Minitab17软件。

2 结果与分析

2.1 己酸菌种子培养周期的确定

按照1.3.1的方法绘制己酸菌种子的生长曲线,结果见图1。由图1可知,己酸菌在6～20 h时为己酸菌的对数生长期,20h时进入减速生长期,30h后进入成熟期。本试验选取己酸菌种子培养周期为15 h,这个时期的己酸菌种子处于对数中期、活性大、适应性强、延滞期短,更利于己酸菌代谢产酸。

图1 己酸菌种子的生长曲线Fig.1 Growth curve of caproic acid bacteria seed

2.2 己酸菌发酵条件优化

2.2.1 发酵温度对己酸菌代谢产酸的影响

考察发酵温度对己酸产量的影响,结果如图2所示。由图2可知,随着发酵温度的上升,己酸产量先升高后降低。当发酵温度为33℃时,最适合己酸菌生长代谢,己酸产量达到最大,继续升高发酵温度,影响了己酸菌的生长和代谢产酸,己酸产量开始下降。因此,选择最佳发酵温度为33℃。

图2 发酵温度对己酸菌代谢产酸的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on acid production of caproic acid bacteria

2.2.2 发酵时间对己酸菌代谢产酸的影响

考察发酵时间对己酸产量的影响,结果如图3所示。由图3可知,发酵时间为3 d时,己酸菌发酵液中未检测到己酸,此时己酸菌正处于生长期；当发酵时间为7～11 d时,己酸产量迅速增加,此时己酸菌处于代谢产酸期,代谢产酸旺盛；当发酵时间为11 d时,己酸产量达到最大值；继续延长发酵时间,此时己酸菌代谢减缓甚至菌体衰亡,己酸产量没有继续增加。因此,选择发酵时间11 d为宜。

图3 发酵时间对己酸菌代谢产酸的影响Fig.3 Effect of fermentation time on acid production of caproic acid bacteria

2.2.3 接种量对己酸菌代谢产酸的影响

图4 接种量对己酸菌代谢产酸的影响Fig.4 Effect of inoculum on acid production of caproic acid bacteria

考察接种量对己酸产量的影响,结果如图4所示。由图4可知,随着接种量的增加,己酸产量呈先升高后下降的趋势。当接种量＜5%时,己酸产量较少,此时己酸菌生物量积累少,进而影响己酸菌代谢产酸；当接种量＞5%时,己酸菌过多消耗碳源、氮源,反而不利于己酸菌代谢产酸。当接种量为5%时,己酸产量达到最高。因此,选择接种量5%为宜。

2.2.4 装液量对己酸菌代谢产酸的影响

图5 装液量对己酸菌代谢产酸的影响Fig.5 Effect of loaded volume on acid production of caproic acid bacteria

考察装液量对己酸产量的影响,结果如图5所示。由图5可知,随着装液量的增加,己酸产量呈先升高后降低的趋势。当装液量＜50 mL/100 mL时,己酸产量较少,由于预留的空间大、氧气含量高,反而不利于己酸菌代谢产酸；当装液量为50 mL/100 mL时,己酸产量达到最高；继续增加装液量,己酸产量开始降低,这可能是由于己酸菌生长环境预留空间小、氧气含量低,从而影响到己酸菌代谢产酸。因此,选择装液量50 mL/100 mL为宜。

2.3 己酸菌发酵培养基组分优化

2.3.1 Plackett-Burman试验结果

利用Minitab17软件对Plackett-Burman试验结果及各因素效应进行分析,结果如表3、表4所示。由表4可知,从主效应可以看出,因素A(乙酸钠)、E(硫酸铵)、G(碳酸钙)、I(对氨基苯甲酸)、K(生物素)对己酸菌代谢产酸影响极显著(P＜0.01),各因素对己酸菌代谢产酸影响的大小顺序为G＞A＞K＞E＞I,其中A、E、G、I为正因素,K为负因素,G的作用主要是中和己酸菌所产的己酸,不是己酸菌生长所需的碳源,加入一定量即可以满足中和己酸的需求,因此不作为进一步优化的因素。A、E作为己酸菌生长所需的碳源、氮源,K、I作为己酸菌生长所需的生长因子,因此,本研究选取A、E、K作为最陡爬坡试验中进一步优化的因素。

表3 Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman试验各因素效应分析Table 4 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.3.2 最陡爬坡试验选取中心点

对Plackett-Burman试验结果进行分析,发现因素A(乙酸钠)、E(硫酸铵)对己酸菌代谢产酸具有正促进作用,K(生物素)对己酸菌代谢产酸具有负促进作用。在最陡爬坡试验中,以0.2和0.1为步长增加培养基中A、E的含量,以-0.01为步长减少K的含量。在进一步研究中,其他因素均取平均水平,对影响效果不进行分析。

最陡爬坡试验设计与结果如表5所示。由表5可知,7号试验组的己酸产量最大,即乙酸钠1.8 g/100 mL、硫酸铵1.2 g/100 mL、生物素0.01 g/100 mL,这说明最大响应区间在7号试验组附近。故以7号试验组的培养基组分为中心复合试验的中心点,进一步优化。

表5 最陡爬坡试验设计与结果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3.3 中心组合设计确定最优组合

根据最陡爬坡试验结果筛选出的试验中心点,以乙酸钠(X1)、硫酸铵(X2)、生物素(X3)进行3因素5水平的中心复合试验,其他因素均取平均水平,共进行20次试验,中心组合设计及结果如表6所示。

表6 中心组合试验的设计及结果Table 6 Design and results of center composite experiments

2.3.4 模型的建立与方差分析

利用Minitab17软件对中心组合试验的数据进行多元回归拟合分析,以乙酸钠(X1)、硫酸铵(X2)、生物素(X3)为影响因素,己酸产量(Y)为响应值,经回归拟合后,己酸产量与乙酸钠、硫酸铵、生物素含量的回归方程表示为：

Y=17.847+0.154X1+0.315X2-0.885X3+0.064X1X2-1.301X1X3+

0.185 X2X3-0.127X12-1.177X22-0.276X32

表7 回归方程的方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

对模型进行方差分析,结果见表7。由表7可知,回归模型极显著(P＜0.01),决定系数R2为0.923,说明回归模型的拟合度很好,表明己酸产量的试验值和预测值有很好的一致性；校正决定系数R2adj为0.854,说明己酸产量的回归模型能够在85.4%的程度上解释试验结果,仅有14.6%不能用这个回归模型表示。其中因素X3、X22、X1X3对己酸菌代谢产酸影响极显著(P＜0.01),其他一次项、二次项、交互项对己酸菌代谢产酸影响均不显著(P＞0.05),失拟项P值为0.563,影响不显著(P＞0.05),进一步说明此模型的拟合度很好。变异系数(variable coefficient,CV)表示试验的精确度,数值越大,表明试验的可靠性越差,本试验中响应值(Y)的CV值为12.238%(＜15%),说明回归模型方程能够较好地反应真实值。综上所述,该回归模型拟合程度好,试验误差小,能够准确的分析和预测己酸的产量。

2.3.5 响应面结果分析及验证试验

利用Minnitab17软件,绘制3因素对己酸菌代谢产酸影响的响应面及等值线,结果见图6。由图6可知,乙酸钠与生物素之间的交互作用对己酸菌代谢产酸影响显著,当硫酸铵添加量为定值,乙酸钠含量在中心点附近时,随着生物素含量梯度减少,己酸产量逐步提高；生物素与硫酸铵之间的交互作用对己酸菌代谢产酸影响不显著,当乙酸钠添加量为定值,硫酸铵在中心点附近时,随着生物素含量梯度减少,己酸产量逐步增加；乙酸钠与硫酸铵之间的交互作用对己酸菌代谢产酸影响也不显著,当生物素添加量为定值,乙酸钠、硫酸铵含量都在中心点附近时,己酸产量最高。

图6 乙酸钠、硫酸铵和生物素的交互作用对己酸菌代谢产酸影响的响应曲面和等值线Fig.6 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between sodium acetate,ammonium sulfate and biotin on acid production of caproic acid bacteria

对多元回归拟合方程进行分析,得出己酸菌发酵培养基的组成为乙酸钠1.644 g/100 mL、硫酸铵1.213 g/100 mL、生物素0.013 g/100 mL,其余组分均取平均值,再结合单因素优化的发酵条件,最终确定己酸菌发酵液的最佳培养工艺。在此培养工艺条件下,进行3次重复验证试验,所得己酸平均产量为18.93 g/L,试验值与回归拟合方程预测值(17.69 g/L)相差7%,再次证实了该模型的有效性。

3 结论

本试验以白酒生产用的己酸菌为研究对象,在单因素的基础上,对其发酵条件进行了优化,在此基础上利用PB试验、最陡爬坡试验、中心组合设计试验、响应面法对其发酵培养基的组成进行了优化,最终确定了最佳的己酸菌发酵液的发酵条件为发酵温度33℃、接种量5%、装液量50 mL/100 mL、发酵时间11 d；发酵培养基的组成为乙酸钠1.644 g/100 mL、硫酸铵1.213 g/100 mL、生物素0.013 g/100 mL、碳酸钙1.0 g/100 mL、磷酸氢二钾0.025 g/100 mL、硫酸镁0.025g/100mL、酵母浸粉0.625g/100mL、乙醇2.5mL/100 mL、对氨基苯甲酸0.062 5 g/100 mL。在此生产工艺条件下,获得的己酸菌发酵液中己酸产量达18.93 g/L,比初始发酵工艺提高了169%,为己酸工业化生产提供了理论依据,同时也为实现白酒机械化生产奠定了基础。

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