响应面法优化桑葚糯米黄酒的发酵工艺研究

孙 敏,高 鑫,李 博,梅 俊,2*

(1.上海城建职业学院 健康与社会关怀学院,上海 201415；2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

桑葚(Fructus mori)是桑科桑属植物,在亚洲、欧洲、非洲、美洲等都有广泛分布［1］。桑葚果营养成分丰富,富含葡萄糖、胡萝卜素、苹果酸、磷质等,除此之外,桑葚果所含的花青素、芦丁和白藜芦醇具有很高的抗氧化活性,能够止血消炎,有很高的药用价值［2-3］。在中国,桑葚果是传统中药,可以保护肾脏和肝脏避免损伤、提高视力,并具有防辐射和抗衰老的作用［4-5］。黄酒起源于中国,是以糯米、粳米、黍米等为主要原料,经加曲、酵母等糖化发酵剂酿制而成的发酵酒,与啤酒、葡萄酒并称为世界三大古酒,享有“国酒”的美誉［6-7］。黄酒营养成分丰富,含有氨基酸、低聚糖、维生素及矿物质元素等,具有降血压、降胆固醇、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等生理作用,是行家推崇的传统保健养生佳品［8］。

在我国,桑葚果的成熟时间集中在4～6月,且桑葚果皮薄、肉软多汁,常温条件下保存时间不超过24 h,极易发生腐烂［9-11］。因此,成熟后的桑葚果需要在短时间内应用于食品生产中。本试验以桑葚汁和糯米为主要原料,通过发酵试验研制桑葚糯米黄酒,利用响应面法优化桑葚糯米黄酒的发酵工艺,以满足消费者对于发酵酒的口味及营养要求,为桑葚果的规模化使用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；桑葚：浙江省临海市涌泉镇某桑树农场；糯米：北大荒农业股份有限公司；异抗坏血酸钠、柠檬酸(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；果胶酶(30 000 IU)：信得利生物工程有限公司；酒类专用活性炭：上海鑫汇活性炭有限公司。

1.2 仪器与设备

SJYZ21D-200低速榨汁机：浙江苏泊尔股份有限公司；自制糯米黄酒生产线一套：由上海城建职业学院黄酒生产实训车间提供；DR101糖度计：上海力辰邦西仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚糯米黄酒酿造工艺流程和操作要点［12-14］

桑葚汁制备：为防止酶促褐变,加入0.10%异抗坏血酸钠和0.10%柠檬酸混合溶液浸泡桑葚果,进行护色约10min,然后将桑葚清洗晾干后利用低速榨汁机进行榨汁,榨汁后立即加热灭酶杀菌(90℃,10 min),以钝化多酚氧化酶的活性和杀死桑葚汁中的微生物,然后加入0.02%果胶酶,静置12 h后过150目筛过滤,利用糖度计测定糖度后冷藏备用。

蒸饭：选择米色洁白、颗粒饱满、气味良好的糯米,清洗干净后放在不锈钢罐槽中于25℃浸泡24 h,用纱布将水沥干后转移到锅中进行蒸煮约40 min,之后摊凉至30℃。

落缸发酵：在米饭中加入一定量的桑葚清汁,进行搅拌混合后放入陶缸,然后加入甜酒曲,混匀后密封,进入主发酵阶段。发酵会产热使发酵温度上升,当温度上升至35℃时要进行首次开耙,每隔5 h开耙一次,四次后改为每天早晚开耙一次。当发酵进入后期陈酿阶段,降低发酵温度至15℃左右,静置,使得酒醪逐渐成熟。经过25 d左右的陈酿,桑葚糯米黄酒已基本成熟。

澄清、过滤：利用200目和400目绢布进行分级压榨过滤,然后采用滤膜孔径为50 000 kDa的聚醚砜膜进行超滤,超滤压力为0.25 MPa,温度为30℃,时间为15 min。以除去发酵后陶缸中的沉降酵母和蛋白质等析出的凝集沉淀,使得酒液澄清。然后添加0.3%酒类专用活性炭JT-450在35℃条件下吸附脱色10 h。对过滤脱色后的酒液进行高温消毒(80℃,20 min)以除去酒液中的微生物,即得到成品。

1.3.2 影响桑葚糯米黄酒发酵效果的单因素试验

考察酒曲用量(0.3 g/100 g、0.4 g/100 g、0.5 g/100 g、0.6g/100 g、0.7 g/100 g、0.8 g/100g)、发酵温度(20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃)、发酵时间(7 d、8 d、9 d、10d、11 d、12d)和桑葚汁用量(5g/100g、10g/100g、15g/100g、20g/100g、25 g/100 g、30 g/100 g)对桑葚糯米黄酒发酵效果的影响。1.3.3响应面法优化桑葚糯米黄酒发酵工艺条件

表1 桑葚糯米黄酒发酵条件优化Box-Behnken设计试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design experiments for fermentation conditions optimization of mulberry Chinese glutinous rice wine

在单因素试验的基础上,根据Box-Behnken的设计原理,选择酒曲用量(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)和桑葚汁用量(D)为考察变量,以产品的酒精度(Y)为响应值,采用响应面法对发酵工艺进行优化,Box-Behnken设计试验因素与水平见表1。

1.3.4 检测方法

酒精度的测定：参考国标GB/T 13662—2008《黄酒》中规定的方法。

感官评价：参考GB/T13662—2008《黄酒》中所列的检测项目。由经过培训的10位感官品评人员对桑葚糯米黄酒的外观、香气、口味进行评定,满分为10分,感官评价标准见表2。

表2 桑葚糯米黄酒感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry Chinese glutinous rice wine

1.3.5 数据分析

应用SPSS19.0软件对实验数据进行统计描述和方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 酒曲用量对桑葚糯米黄酒发酵的影响

图1 酒曲用量对感官评分和酒精度的影响Fig.1 Effect of distiller's yeast addition on sensory score and alcohol content

由图1可知,当酒曲用量为0.3～0.6 g/100 g时,桑葚糯米黄酒的酒精度和感官评分随着酒曲用量增大而增加；当酒曲用量为0.6 g/100 g时,酒精度和感官评分均达到最大值；当酒曲用量＞0.6 g/100 g时,酒精度和感官评分均呈现下降趋势。原因可能是前期酒曲微生物中的微生物由于营养充足而快速生长繁殖,到后期发酵体系营养供应不足,酵母菌无氧呼吸作用被抑制导致乙醇产生减少。同时,发酵过程中一部分乙醇被代谢生成乙酸参与乙酯类风味化合物的形成,导致乙醇含量降低。当酒曲用量较大时,酒曲中酸性蛋白酶和酸性羧(基)肽酶数量较多,主发酵时生成氨基酸、高级醇数量多,且各种霉菌孢子后期自溶,产生强烈苦味物质,给黄酒带来较重苦味［15］。因此,选择酒曲用量0.6 g/100 g为宜。

2.1.2 发酵温度对桑葚糯米黄酒发酵的影响

图2 发酵温度对感官评分和酒精度的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on sensory score and alcohol content

由图2可知,随着发酵温度的增长,桑葚糯米黄酒的酒精度呈先增加后趋于平稳的趋势,当发酵温度＞22℃时,感官评分迅速增加,较低发酵温度不利于酵母菌发酵,酒母中糖原得不到迅速降解,感官评分较低［16］。随着发酵温度的升高,有利于酵母菌生长繁殖和发酵作用,可以在代谢中产生更多的酒精。当发酵温度为26℃时,感官评分达到最大值；当发酵温度＞26℃时,酵母菌酶活升高代谢加快,造成后发酵力下降,酒精度略有降低。同时,对于桑葚糯米黄酒的风味化合物的形成和积累产生不利影响,最终导致感官下降。因此,选择发酵温度为26℃比较合适。2.1.3发酵时间对桑葚糯米黄酒发酵的影响

图3 发酵时间对感官评分和酒精度的影响Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score and alcohol content

由图3可知,发酵时间的延长有利于桑葚糯米黄酒的酒精生成,感官评分则呈先增加后降低的趋势。当发酵时间为10 d时,感官评分达到最大值,酒精度也达到较大值,继续增加发酵时间,感官评分开始下降,酒精度也略有下降。可能是由于在发酵过程中发酵时间过长引起发酵过度,菌体自溶,部分酒精被酒曲中的细菌转化成小分子有机酸,会使黄酒在感官上显得味酸、刺舌、粗糙等,引起感官评分较低［17］。因此,选择发酵时间10 d为宜。

2.1.4 桑葚汁用量对桑葚糯米黄酒发酵的影响

图4 桑葚汁用量对感官评分和酒精度的影响Fig.4 Effect of mulberry juice addition on sensory score and alcohol content

由图4可知,随着桑葚汁用量的增加,酒精度和感官评分均呈先增加后下降的趋势。当桑葚汁用量为15%时,酒精度达到最大值,之后桑葚汁用量的增加酒精度开始出现明显的下降,这可能是桑葚汁的添加稀释了发酵液,固形物含量不足,导致发酵后酒精度过低。当桑葚汁少量添加桑升值会提高桑葚糯米黄酒的感官品质,当桑葚汁用量继续增大时,桑葚汁香味过重,掩盖了酒中的酒精和其他挥发性风味化合物所带来的香气和口感,口感变差。因此,选用桑葚汁用量20%为宜。

2.2 响应面优化试验结果与分析

为获得桑葚糯米黄酒的最佳发酵条件,在单因素试验结果的基础上,按照Box-Behnken试验设计原理,采用响应面试验进行优化,试验设计与结果见表3,采用Design Expert软件对试验数据进行方差分析,结果见表4。

用Design Expert统计软件对表4中的试验数据进行二次回归分析,得到多元二次回归方程为：

Y=14.36+0.062 5A+0.10B+0.58C-0.04D+0.0125AB+0.025AC-0.05AD-0.05BC+0.05BD-0.025CD-0.28A2-0.22B2-0.46C2-0.05D2

由表4可知,多元二次回归方程模型P＜0.000 1,表明该模型极显著(P＜0.01),说明方程的拟合度较好,试验误差小,因此该模型可以真实地拟合和推测实际情况；模型的决定系数R2=0.947 5,该模型是比较合适的。失拟项不显著(P=0.381 1＞0.05),说明试验所得二次回归方程预测模型能很好地对响应值进行预测。4个因素对酒精度的影响大小依次为C(发酵温度)＞B(发酵时间)＞A(酒曲用量)＞D(桑葚汁用量)。一次项C、二次项A2、B2、C2对响应值的影响极显著(P＜0.01)；一次项B影响显著(0.01＜P＜0.05)；其他因素影响不显著(P＞0.05)。

表3 桑葚糯米黄酒发酵条件优化响应面试验设计与结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of mulberry Chinese glutinous rice wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

续表

2.3 响应面及等高线分析结果

图5 酒曲用量、发酵温度和发酵时间交互作用对桑葚糯米黄酒酒精度影响的响应曲面及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between distiller's yeast addition,fermentation temperature and time on alcohol content of mulberry Chinese glutinous rice wine

对二次回归方程优化的响应面曲面图见图5,曲面图的形状可反应出单因素对酒精度的影响,曲面越陡峭,影响越显著,拟合的响应面比较直观地反映了各因素间的交互作用。由图5A可知,随着酒曲用量的增加和发酵时间的延长酒精度呈先上升后下降趋势,曲面图较走峭,说明酒曲用量和发酵时间对于酒精度的影响较为明显。图5B和图5C表明,酒精度随着发酵温度升高呈现上升趋势,随着酒曲用量和发酵时间先增加后减少,两因素之间有明显的交互作用,且发酵温度对酒精度的影响大于酒曲用量因素。

根据建立的数学模型利用Design Expert软件对参数进行分析,得到桑葚糯米黄酒最优发酵条件为：酒曲用量0.62 g/100 g、发酵温度25.3℃、发酵时间10.08 d、桑葚汁用量16.7 g/100 g,酒精度为14.57%vol。为检验试验结果的可靠性,考虑到实际操作的便利,将工艺参数修正为酒曲用量0.60 g/100 g、发酵温度25℃、发酵时间10 d、桑葚汁用量17.0 g/100 g。经过3次平行试验,得到桑葚糯米黄酒的酒精度14.46%vol,与预测值的相对误差为0.78%,与预测结果相符。因此,采用响应面法优化得到的桑葚糯米黄酒主发酵工艺最优条件符合实际。经过滤、杀菌后所得到的桑葚糯米黄酒感官评分9.05分,呈紫黄色、清亮透明；口味醇和、爽口,具有少量的桑葚味；有浓郁醇香,无异味；酒体协调。3结论

本研究采用响应面法对桑葚糯米黄酒发酵工艺进行优化,结果表明,发酵温度和发酵时间对桑葚糯米黄酒的酒精度有显著影响。桑葚糯米黄酒的最佳发酵工艺条件为酒曲用量0.60 g/100 g、发酵温度25℃、发酵时间10 d、桑葚汁用量17.0g/100g,所得桑葚糯米黄酒的酒精度为14.46%vol,感官评分9.05分,呈紫黄色、清亮透明；口味醇和、爽口,具有少量的桑葚味；有浓郁醇香,无异味；酒体协调。以桑葚、糯米为主要原料酿制黄酒为桑葚的深度开发提供了新方法,而且丰富了黄酒的花色品种,满足了消费者对黄酒多样性和养生功能的需求。

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