丙酮酸乙酯对利福平致小鼠肝损伤的保护作用

李晓理

利福平(rifampicin, RFP)是世界卫生组织推荐的一线抗结核药物之一。利福平单独或者与其他抗结核药物联合使用时，都可引起不同程度的肝损伤，但具体的发病机制仍未明确。高迁移率族蛋白BI (high mobility group box-1, HMGB1) 是近年研究发现的一种强大的致炎细胞因子，可能与异烟肼、利福平合用所致的大鼠肝损伤有关[1]。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate, EP)作为一种有效的HMGB1释放抑制剂，可降低脓毒症、蛛网膜下腔出血、肝癌等动物模型的死亡率[2-4]。目前，尚未见EP防治利福平致肝损伤的作用及其机制的报道。因此，本实验通过复制利福平致肝损伤小鼠模型，探讨EP对利福平致肝损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级C57BL/6小鼠24只，体质量18～20 g，由南京大学-南京生物医药研究院提供[许可证号：SCXK(苏)2015-0001]。

1.1.2 药品及试剂 利福平，5 g/瓶，批号R3501，美国Sigma公司生产；丙酮酸乙酯，25 g/瓶，批号E47808，美国Sigma公司生产；HMGB1多克隆抗体，1 mg/mL，批号A515，北京博奥森生物技术有限公司；小鼠血清生化检测试剂，购自瑞士Roche公司；小鼠蛋白测定试剂盒、总胆汁酸(total bile acids, TBA)测定试剂盒、乙酰化高迁移率族蛋白B1(acetylated-high mobility group box-1, AC-HMGB1)测定试剂盒均由上海联硕生物科技有限公司生产；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所生产。

1.1.3 仪器 全自动生化分析仪，瑞士Roche Modular DPP产品；紫外分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；光学显微镜，日本Nikon公司产品；成像系统，美国阿尔法公司产品。

1.2 动物分组、模型建立及给药

1.2.1 药物配备 RFP灌胃液配制：将RFP溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中配置成浓度为10 g/L的混悬液；EP液配制：将EP溶解到格林液中，配置成3.26 g/L的溶液，消毒，4℃冰箱保存备用。

1.2.2 模型建立和动物分组 参考文献[5-6]。将小鼠适应性喂养1周后随机分为正常对照组、模型组和EP组，每组8只。常规颗粒饲料喂养，自由进食进水，室温22～25℃，相对湿度(50±5)%，明暗各12 h。正常对照组、模型组和EP组分别给予等量溶剂(0.5%羧甲基纤维素钠)、利福平200 mg·kg-1·d-1、利福平200 mg·kg-1·d-1，每天1次定时空腹灌胃。EP组给予腹腔注射丙酮酸乙酯40 mg·kg-1·d-1，其余两组每天1次腹腔注射等量溶剂(格林液)。连续给药7 d后，处死全部小鼠。

1.2.3 标本采集 小鼠处死前，隔夜禁食、禁水12 h。处死前称量小鼠体质量，腹腔注射10%的水合氯醛(4 mL/kg)，麻醉后摘除眼球取血、摘取小鼠肝脏。留取血清标本，-80℃冻存待测；称肝脏湿重，计算肝指数(肝指数=肝湿重/小鼠体质量×100%)；各组切取相同部位肝组织，10%福尔马林缓冲液固定，用于观察肝脏病理变化；余组织保存于液氮罐中，待测。

1.3 观察指标及测定方法

1.3.1 一般情况观察 每3天称小鼠体质量1次，观察并记录其体质量变化、饮食情况、毛色、皮肤黏膜颜色、大小便、精神状态及对外界刺激的反应情况等。

1.3.2 血清生化指标测定 用生化分析仪测定各组小鼠血清总胆红素(total bilirubin, TBIL)、直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的水平。

1.3.3 肝组织病理学检查 常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。在光学显微镜下，观察肝组织的病理形态学变化[2]。

1.3.4 免疫组化法检测肝组织中HMGB1蛋白的表达 免疫组化染色法采用PV二步法，参考试剂盒说明书操作。HMGB1多克隆抗体工作浓度1∶50。染色完成后，镜下摄片。每张切片在高倍显微镜下(400倍)随机选取5个不连续视野，用Image-Pro Plus 6.0测定平均光密度值(OD)。

1.3.5 肝组织匀浆 取肝组织100 mg，匀浆取上清液；采用考马斯亮蓝法测定肝组织蛋白浓度，ELISA法测肝组织TBA、AC-HMGB1的含量，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，羟胺法测定SOD活性，按照试剂盒说明书步骤进行操作。

2 结果

2.1 一般情况 正常对照组小鼠精神状态、食欲较好，毛色光泽尚可，无黄染，对外界刺激反应较灵敏。模型组小鼠精神状态差，脚掌可见轻度橘黄染，大小便呈橘红色，进食和活动情况较前减退，体质量较前轻度下降，对外界刺激反应迟钝。EP组小鼠精神状态稍差，脚掌皮肤黄染程度、大小便颜色较模型组均减轻，体质量较前稍增长，对外界刺激反应尚可。造模后第7天模型组小鼠肝湿重及肝指数较正常对照组升高(P<0.05)，EP组小鼠肝湿重及肝指数较模型组降低(P<0.05)。详见表1。

表1 造模后第7天3组小鼠体质量、肝湿重、肝指数比较

2.2 血清肝生化指标变化 与正常对照组比较，模型组的血清TBIL、DBIL、ALP、ALT升高(P<0.05)；与模型组相比，EP组的TBIL、DBIL、ALP、ALT降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠血清生化指标变化

2.3 肝脏大体形态及组织病理学变化 正常对照组小鼠肝脏颜色红润，被膜光滑，边缘锐利，质地柔软，镜下肝小叶清晰可见，肝细胞排列整齐，肝细胞未见异常。模型组小鼠肝脏部分偏黄，边缘稍钝，质地基本柔软，镜下可见肝细胞排列紊乱，中央静脉周围的肝细胞可见明显的空泡变性、脂肪变性，部分肝细胞可见嗜酸性变、核溶解或固缩。EP组小鼠肝脏外观基本正常，肝小叶结构基本完整，肝细胞空泡变性、脂肪变性较模型组明显减轻。详见图1。

图1 各组小鼠肝脏病理学改变(HE×400)

2.4 肝组织HMGB1的表达情况 光镜下可见，正常对照组小鼠肝细胞HMGB1微量表达，胞浆内和细胞核均可见淡黄、棕黄色着色(见图2)，其中阳性表达多位于肝细胞核中，OD值为 (0.18±0.027)。模型组小鼠肝细胞HMGB1的表达增强，胞浆内和细胞核中着色增强，且胞浆中阳性表达增强 (见图2)，OD值为(0.30±0.039)，高于正常对照组(P<0.001)。EP组小鼠肝细胞HMGB1表达较模型组减少，阳性表达多位于肝细胞核中(见图2)，OD值为(0.24±0.016)，低于模型组(P<0.001)。 三组间比较差异有统计学意义(F=56.37，P<0.001)。

图2 各组小鼠肝HMGB1的表达(IHC×400)

2.5 肝组织中AC-HMGB1、TBA、SOD、MDA的水平 与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中AC-HMGB1、TBA、MDA升高(P<0.05)，SOD下降(P<0.05)；与模型组比较，EP组小鼠肝组织中的AC-HMGB1、TBA、MDA降低(P<0.05)，SOD升高(P<0.05)。详见表3。

表3 各组小鼠肝组织中AC-HMGB1、TBA、MDA、SOD水平变化

3 讨论

利福平广泛用于抗结核治疗，单独或者与其他抗结核药物联用时均可引起不同程度的肝损伤，是抗结核药物最常见的毒副作用之一，也是结核患者停止治疗的最常见的原因之一。因此，研究利福平致肝损伤的发病机制及其防治手段具有重要的临床意义。

本实验结果显示，C57BL/6小鼠给予利福平灌胃7 d后肝细胞出现明显的空泡变性、脂肪变性，部分肝细胞有嗜酸性变，核溶解或固缩，同时伴有血清TBIL、DBIL、ALP、ALT及肝组织TBA水平明显升高。表明已成功复制出利福平致肝损伤小鼠模型，但脂肪变性及炎症反应不及文献[5]报道明显，考虑可能与小鼠品系不同有关。

HMGB1是一类广泛存在于真核细胞内的非组蛋白，对维持核小体稳定、DNA 重组、复制、修复及转录有重要作用[7]。当外界有适当的信号刺激细胞时，HMGB1赖氨酸残基被乙酰化，然后释放到细胞外，参与炎症反应[8]。AC-HMGB1参与了梗阻性胆汁淤积性肝损伤的发病及发展过程[9]，降低HMGB1的乙酰化水平可以明显改善脓毒症相关性脑病的认知功能障碍、减轻肝组织缺血再灌注损伤的程度[10-11]等。AC-HMGB1可作为药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI)的免疫损伤指标，对判断DILI的严重程度及预后有重要价值[12]。前期实验[2]表明，HMGB1表达增加与分布异常与异烟肼联用利福平致大鼠肝损伤的发生及发展有关。本实验研究显示，正常对照组肝细胞HMGB1微量表达，且阳性表达多位于细胞核中，与文献[2]报道有差异，可能与不同实验中所用鼠的种属不同有关，但不能排除不同实验中所用不同溶剂的影响，可能需进一步验证。模型组肝细胞HMGB1的表达增多，胞浆明显，且AC-HMGB1的表达明显增多，同时HMGB1的表达强度和分布与肝脏的病理严重程度相一致，提示HMGB1表达增加和分布异常、AC-HMGB增加与利福平致肝损伤的发生发展有关。

MDA、SOD分别是反应机体内氧化、抗氧化程度的重要指标。本实验研究发现，利福平可以导致小鼠肝组织中MDA水平升高，SOD活性降低，与文献[13]报道相符；予以EP干预后，MDA水平下降，SOD活性升高。提示EP可以通过抗氧化作用减轻利福平致小鼠肝损伤。

EP作为一种有效的HMGB1释放抑制剂，不仅可以抑制HMGB1的基因转录和蛋白合成，而且可以降低HMGB1的乙酰化程度，减少HMGB1释放到细胞外，减轻促炎细胞因子反应网络的级联反应，达到对脏器的保护作用[14]。本研究结果显示，EP可显著减轻小鼠肝组织的病理损伤，同时降低肝组织HMGB1和AC-HMGB1的表达。说明EP可以通过降低小鼠肝组织中HMGB1及AC-HMGB1的水平来减轻利福平致小鼠肝损伤的程度。

HMGB1是损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)中的一员，由215个氨基酸组成，其23、45、106位点上的半胱氨酸残基使HMGB1成为一种氧化还原敏感分子；它的易位、释放和活动均受到氧化还原反应的严格控制[15]。随着活性氧自由基的积累，巨噬细胞等炎症细胞可产生大量的HMGB1并促使其乙酰化释放到细胞外，同时HMGB1又可以通过释放炎症因子来促进机体的氧化应激。丙酮酸乙酯是一种有效的抗氧化剂，其抗氧化机制可能与其a-酮羧基及亲脂特性有关，a-酮基可直接与过氧化物产生还原反应，清除过氧化物及其氧自由基等有害物质[16]。严重烫伤内毒素血症大鼠TNF-a和HMGB1水平与丙二醛水平呈正相关，与SOD活性呈负相关，予以丙酮酸乙酯抗氧化应激后，可以减轻炎症反应[17]。本研究结果显示，丙酮酸乙酯降低HMGB1及其乙酰化水平、减轻利福平致小鼠肝损伤的程度的作用，可能与其抗氧化作用有关，但具体机制仍需进一步研究。

综上所述，HMGB1表达、分布异常及AC-HMGB1与利福平致小鼠肝损伤的发生与发展有关；丙酮酸乙酯可通过抗氧化，降低HMGB1及其乙酰化水平、调节HMGB1分布来减轻利福平致药物性肝损伤。HMGB1有望成为防治利福平致肝损伤的一个关键靶点。

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