ALCAM基因1沉默对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制

活化白细胞黏附分子(actived leukocyte cell adhesionmolecule，ALCAM)，又称CD166和MEMD，是一种广泛存在于人体组织器官的跨膜糖蛋白受体，主要表达于白细胞和胸腺上皮细胞，是免疫球蛋白基因超家族成员，具有广泛生理病理功能[1-2]。临床数据[3-5]显示，ALCAM的表达与肿瘤大小、肿瘤的恶性程度和临床分期有关，这表明在肿瘤细胞中ALCAM的高表达反映了肿瘤的恶性程度，并且可以预示肿瘤的浸润和疾病进展。近年来，有研究[6]表明，ALCAM在胃癌的表达可能参与了肿瘤转移和侵袭。本研究通过构建ALCAM shRNA表达质粒，抑制ALCAM基因表达，观察其对人胃癌细胞SGC-7901生物学活性的影响，为胃癌的治疗找到新的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料 人胃癌细胞SGC-7901由郑州大学附属肿瘤医院病理科冻存；质粒pGenesil-1-ALCAM shRNA和pGenesil-1-control shRNA(非特异性shRNA)由郑州大学附属肿瘤医院病理科构建并验证；总RNA提取试剂盒(DP405)、逆转录试剂盒(KR103)购自天根生化科技有限公司；2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Q111)购自南京诺唯赞生物有限公司；兔抗人CD166单克隆抗体[EPR2759(2)]购自美国Abcam公司；蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)多克隆抗体(4272)、AKT多克隆抗体(Ser473)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein，mTOR)多克隆抗体(2972)和mTOR多克隆抗体(Ser2448)购自美国CST公司；Caspase-3单克隆抗体(3F49)购自美国Santa cruz公司；CCK-8试剂盒(C0037)、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(C1063)购自碧云天生物技术研究所。6～8周裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号:SCXK(沪)2007-0005。

1.2 人胃癌细胞SGC-7901培养及转染 取冻存的人胃癌细胞SGC-7901，37.0℃水浴箱快速振荡融化，加入RPMI 1640 培养基，800 r/min，离心半径17.39 cm，离心时间 5 min；弃上清液，加入含10% FBS的 RPMI 1640 培养基；重悬后接种于培养皿中；重悬细胞后分装，37℃、5%CO2培养箱中培养；待细胞生长至90%融合度时，胰酶消化传代培养，按5×106个细胞密度接种于10 cm细胞培养皿中，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养至80%融合；将细胞分为两组：ALCAM shRNA组和对照shRNA组，分别将重组质粒pGenesil-1-ALCAM shRNA和pGenesil-1-control shRNA与脂质体Lipofectamine 2000转染试剂混合后加入培养皿中，充分混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养；6 h后更换10% FBS的 RPMI 1640 培养基；24 h 后向培养皿内加入含有 1.5 mg/mL G418 的完全培养液；3 d换液1次，待培养板内可看到单克隆，换成无抗菌药物的完全培养基，荧光显微镜下观察细胞病变及绿色荧光蛋白的表达情况。

1.3 RT-PCR检测ALCAM mRNA表达水平 待细胞转染48 h后，取各组细胞，弃上清，PBS洗涤；加入Trizol溶液1 mL，充分混匀，静置5 min；用移液管将细胞悬液移入EP管中，加0.2 mL氯仿，充分振荡后室温静置 5 min；4℃，12 000 r/min，离心半径17.39 cm，离心15 min；将上层水相移至新的EP管，加等体积异丙醇，充分混匀冰上静置10 min；4℃，12 000 r/min，离心10 min；弃上清，加入等体积75%的乙醇洗涤；4℃，8 000 r/min，离心10 min；弃上清，冰上干燥10 min；DEPC水溶解沉淀，紫外分光光度计测定 RNA 溶液浓度；根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成单链cDNA。设计ALCAM引物如下：5’-TTTTACTTACCAGGACAGC-3’(ALCAM-F)，5’-GACATAGTTTCCAGCATC-3’(ALCAM-R)，5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’(GAPDH-F)，5’- GC GCCCAATACGACCAAATC -3’(GAPDH-R)。实时定量PCR反应体系如下：SYBR Green master mix 12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1.25 μL，用双蒸水补至20 μL；反应条件：95℃ 3 min 预变性，95℃ 30 s变性，50℃ 30 s退火延伸，72℃延伸45 s，共40个循环，72℃ 5 min；读取数据，定量分析；2% 琼脂糖凝胶电泳分析确定PCR产物。

1.4 Western blot检测ALCAM蛋白表达水平 待细胞转染72h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次；加入1 mL预冷RIPA 蛋白裂解缓冲液，冰上裂解15 min；4℃，12 000 r/min，离心半径17.39 cm，离心15 min；取上清即总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度；取EP管，分别加入各组蛋白样品；加入Loading Buffer 混匀，煮沸10 min，变性；10%SDS-PAGE电泳分离；将蛋白转移至PVDF膜；5%的BSA封闭30 min；兔抗人CD166单克隆抗体4℃孵育过夜；PBST洗涤2次，每次5 min；鼠抗兔IgG单克隆抗体室温孵育1 h；PBST洗涤2次，每次5 min；DAB显色，拍照。同时以β-actin作为内参抗体，应用凝胶成像系统分析计算各组细胞中ALCAM蛋白的相对表达量。

1.5 CCK-8法检测胃癌细胞SGC-7901增殖情况 所有步骤严格按照CCK-8试剂盒说明书进行；分别取转染后各组细胞，调整细胞浓度至2×104/mL，接种至96 孔板，每孔100μL，设立3个复孔；在37℃、5% CO2培养箱中分别培养12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液；37℃、5%CO2培养箱中培养4 h；酶标仪测定450 nm处的OD值，绘制生长曲线。

1.6 ALCAM蛋白对胃癌细胞体内成瘤的影响 将ALCAM shRNA和对照shRNA稳定转染的SGC-7901胃癌细胞浓度调整为1×107/mL，分别于10只裸鼠腋下脂肪垫接种细胞100 μL，在接种后第12天，采用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，并按照公式V=1/2(长×宽)计算肿瘤体积。

1.7 流式细胞术检测胃癌细胞SGC-7901凋亡水平 分别收集转染48 h后各组细胞，置于流式管中，PBS洗涤2次；1 000 r/min，离心半径17.39 cm，离心5 min；加入100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞；分别加入5 μL Annexin V-FITC和 PI Staining Solution，充分混匀，室温下避光反应15 min；加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀；在1 h内用流式细胞仪进行细胞凋亡检测，以未转染组SGC-7901细胞进行荧光补偿调节，检测各转染组细胞的凋亡率。

1.8 ALCAM蛋白介导的下游信号通路分析 采用Western blot分析AKT-mTOR信号通路的激活以及凋亡信号通路相关的表达水平。Western blot操作方案按照1.4方法进行。

2 结果

2.1 ALCAMshRNA转染SGC-7901细胞 经脂质体转染48 h后，倒置荧光显微镜下可观察到3组细胞有80%以上的细胞内有绿色荧光蛋白表达。详见图1。

图1 脂质体转染后SGC-7901细胞(×10)

2.2 ALCAM mRNA表达水平比较 与对照 shRNA组比较，ALCAM shRNA组细胞ALCAM mRNA电泳条带减弱。定量分析结果显示，与对照 shRNA组(1.01±0.26)比较，ALCAM shRNA组细胞ALCAM mRNA(0.12±0.06)下降，差异有统计学意义(t=3.918,P<0.001)。详见图2。

2.3 ALCAM蛋白表达水平比较 与对照shRNA组(1.66±0.23)比较，ALCAM shRNA组细胞ALCAM蛋白表达水平(0.23±0.09)下降，差异有统计学意义(t=4.019,P<0.001)。详见图3。

图2 ALCAM mRNA表达水平比较

图3 ALCAM蛋白表达水平比较

2.4 增殖和体内肿瘤生长比较 与对照 shRNA组比较，ALCAM shRNA组细胞增殖活性下降，生长速率缓慢(F=3.154，P=0.014)。与对照shRNA组比较，ALCAM shRNA组肿瘤生长速度降低(F=4.094，P=0.004)。详见表1、2。

表1 两组细胞增殖能力比较

表2 两组细胞在体内成瘤后体积变化比较

2.5 细胞凋亡水平比较 Annexin V-FITC/PI双染检测结果示，ALCAM shRNA组细胞凋亡率为(23.65±6.82)%，高于对照shRNA组的 (2.41±0.82)%，差异有统计学意义(t=5.871,P<0.001)。

2.6 ALCAM敲低对AKT、mTOR和凋亡蛋白Caspase-3的影响 Western blot结果显示，与对照shRNA组比较，ALCAM shRNA组细胞AKT和mTOR磷酸化水平下调。详见图4。

图4 ALCAM敲低对AKT-mTOR和凋亡蛋白Caspase-3的影响

3 讨论

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，临床上大部分患者发现胃癌时已处于进展期或晚期，手术切除效果不佳，传统的放化疗效果亦不理想，5年生存期低于50%，预后较差[7]。胃癌细胞的生长、增殖、凋亡及远处转移等恶性事件受到多种分子的调控，寻找敏感而特异的肿瘤标志物，特别是分子标志物，从分子水平上研究胃癌细胞的生物学特性，了解胃癌发生发展过程中复杂的调控机制，将为找到有效的治疗策略提供理论基础[8-9]。

ALCAM广泛分布于活化的白细胞、单核细胞、内皮细胞、造血干细胞、骨髓细胞等细胞中。ALCAM参与机体炎症反应、细胞黏附、造血、外周及中枢系统发育以及肿瘤的侵袭[10]。自发现以来，ALCAM已被证实高表达于乳腺癌、前列腺癌、食管癌、结肠癌等多种肿瘤细胞表面，可以导致肿瘤的发生、发展及转移。研究[11-12]显示，ALCAM与患者的生存、复发及预后密切相关。

本研究在细胞水平上分析了ALCAM蛋白对胃癌细胞生物学功能的影响，结果显示，ALCAM敲低的细胞增殖明显减缓，而细胞凋亡水平则显著增高，说明ALCAM可能参与了肿瘤细胞的增殖和凋亡。AKT-mTOR信号通路是细胞增殖主要的信号通路之一，其也在肿瘤发生过程中发挥着重要作用[13]。本研究发现，ALCAM敲低后AKT和mTOR总蛋白水平表达无差异，但是AKT和mTOR磷酸化的水平明显下降，这一结果提示ALCAM可能通过AKT-mTOR信号通路发挥功能。肿瘤组织中ALCAM蛋白的高表达可能导致AKT-mTOR信号通路的过度激活，进而导致细胞增殖加快，当ALCAM敲低时细胞生长减慢。此外，笔者发现ALCAM蛋白敲低的细胞中Caspase-3的表达水平明显增加。Caspase-3是细胞凋亡通路中主要的执行分子，可以剪切下游很多蛋白，激活凋亡信号通路[14]。Caspase-3蛋白水平的上调，导致细胞凋亡的发生，这一结果与ALCAM蛋白敲低后细胞凋亡增加的细胞生物学表型一致。

综上所述，ALCAM基因沉默能够显著抑制胃癌细胞的增殖速率，并增加其凋亡率，为研发胃癌新的分子标志物和潜在治疗靶点奠定了基础。

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