液相色谱-串联质谱法快速测定乳制品中5种激素残留

张云伟*， 黄优生， 胡海山， 鄢 兵

(江西省分析测试研究所,江西南昌 330029)

近年来，婴幼儿配方乳粉中激素残留引起了人们的注意。不过，包括酸奶在内的液体乳制品中激素检测的研究报道并不多。本文重点选取5种激素，对包括奶粉、乳饮料、酸奶在内的乳制品样品进行相关残留检测的方法研究。目前国内外已有许多关于激素检测的标准与文献报道，主要采用液相色谱法[1]、酶联免疫吸附分析[2]、液相色谱-质谱联用[3 - 5]与气相色谱-质谱联用[6 - 7]等方法。液相色谱法灵敏度低；酶联免疫法操作步骤多，假阳性率较高；气相色谱-质谱联用测定激素时具有较高的灵敏度，但需要长时间的衍生化过程。液相色谱-质谱联用测定激素时不仅具有较高灵敏度，而且不需要衍生就可以直接测定，提高了分析样品的工作效率。

本方法在已有的标准与文献研究的基础上，优化了提取、净化、色谱测定等参数，成功建立了固相萃取(SPE)净化、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定液体乳制品中雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、已烷雌酚和孕酮5种激素的分析方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，Agilent 6410高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪(美国，Agilent公司)；HC-3514高速离心机(科大创新股份有限公司)；DC-12氮吹仪(上海安谱科学仪器厂)；XH-B型涡旋混合器(江苏康健医疗用品有限公司)；Milli-Q去离子水制备系统(美国，Millipore公司)；KQ-5200DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。CNWBOND NH2SPE小柱(500 mg/3mL)，CNWBOND LC-C18 SPE小柱(500 mg/3mL)，Poly-Sery HLB SPE小柱(60 mg/3mL)，Poly-Sery HLB SPE小柱(60 mg/3mL)。

标准品：雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮(德国Dr.Ehrenstorfer公司)。标准品溶液的配制:分别准确称取雌酮、已烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和孕酮标准品各10 mg，置于50 mL容量瓶中,加入一定量的乙腈超声溶解，冷却至室温，然后定容至刻度，摇匀，得浓度为0.2 mg/mL的混合对照品储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。然后再吸取储备液1 mL于20 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，制备成10.0 μg/mL的标准工作液。乙腈(色谱纯，Tedia公司)；甲醇(色谱纯，Sigma-Aldrich公司)。实验用水为超纯水。

乳制品购自当地超市。

1.2 样品处理

液体乳制品：准确称取5.00 g样品，置于50 mL带螺旋盖的聚丙烯离心管中，加入20 mL甲醇，涡旋混匀1 min，以3 500 r/min离心5 min，残渣再加10 mL甲醇重复提取一次，合并上清液，于50 ℃真空浓缩至近干；加入1 mL甲醇超声溶解，加10 mL水，过SPE小柱，用3 mL 10%甲醇淋洗，5 mL甲醇洗脱，50 ℃水浴氮气吹干；加入1 mL 50%乙腈溶液，涡旋溶解，经0.22 μm滤膜过滤后，滤液供LC-MS/MS测定。

固体乳制品：准确称取2.00 g样品，置于50 mL带螺旋盖的聚丙烯离心管中，加入5 mL水涡旋混匀1 min，加入20 mL甲醇，涡旋混匀1 min，以3 500 r/min的转速离心5 min，残渣再加10 mL甲醇重复提取一次，合并上清液，于50 ℃真空浓缩至近干；加入1 mL甲醇超声溶解，加10 mL水，过SPE小柱，用3 mL 10%甲醇淋洗，5 mL甲醇洗脱，50 ℃水浴氮气吹干；加入1 mL 50%乙腈水溶液，涡旋溶解，经0.22 μm滤膜过滤后，滤液供LC-MS/MS测定。

1.3 液相色谱-串联质谱条件

液相色谱条件：色谱柱:ZORBAX SB -C18柱(100×2.1 mm,3.5 μm)。ESI负离子模式：流动相为乙腈(A)与5 mmol/L乙酸铵溶液(B)，梯度洗脱程序：0～1 min，10%～80%A；1～3 min，80%A；3～3.1 min，80%～10%A；3.1～8 min，10%A。流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：40 ℃。ESI正离子模式：流动相为乙腈(A)与0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱程序：0～1 min，30%～80%A；1～3 min，80%A；3～3.1 min，80%～10%A；3.1～8 min，10%A。流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL；柱温：40 ℃。

串联质谱条件：离子源:电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应监测(MRM)；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：10 L/min；雾化气压力：275.8 kPa；毛细管电压：4 000 V；电子倍增管电压：300 V。每种化合物的离子源模式、母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 5种激素的质谱采集参数Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 5 hormones

*quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 固相萃取净化条件的选择

实验分别用不同比例的甲醇水溶液和水溶解样品残渣后采用固相萃取柱净化，结果表明上样溶液中甲醇含量低于20%时，5种目标激素能完全保留在固相萃取柱中。为了保证所有目标物均能保留在固相柱中，选用20%甲醇作为上样液。实验分别试验了CNWBOND LC-C18 SPE小柱、Poly-Sery HLB SPE小柱、CNWBOND NH2SPE小柱、Poly-Sery HLB SPE小柱、石墨化碳黑小柱，对加标后液体奶的净化效果及回收率。结果显示前两种SPE小柱的净化效果好，考虑价格因素，本实验采用CNWBOND LC-C18 SPE小柱来净化样品。

2.2 质谱条件的优化

采用1 μg/mL单标准溶液，以流动注射的方式在正、负离子模式下进行母离子全扫描，确定化合物的分子离子。孕酮在正离子模式下得到信号较强的母离子[M+H]+；已烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、己烷雌酚在负离子模式下才能获得准分子离子峰[M-H]-。再分别以待测物的分子离子峰为母离子，进行子离子全扫描，选取丰度较强、干扰较小的两个子离子作为定性与定量离子，优化得到的质谱参数见表1。

2.3 色谱条件的优化

已烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、己烷雌酚作为雌激素，在流动相中加入乙酸铵可以增加其离子化效率，本研究用乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相进行色谱条件的优化。孕酮作为孕激素，在流动相中加入甲酸可以增加其离子化效率，本研究用体积分数为0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相进行色谱条件的优化。采用梯度洗脱的方法，可以获得较好的实验结果(图1)。

图1 5种激素的多反应监测(MRM)色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 5 hormones1:estrone，2:diethyostilbestrol，3:dienestrol,4:hexestrol，5:progesterone.

2.4 线性范围和检出限

用流动相逐级稀释标准品贮备液，得一系列浓度的标准工作溶液，以浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标制作标准曲线，考察峰面积与浓度的线性关系。以逐渐降低样品中标准溶液添加量的方法进行实验，根据标准曲线，以10倍信噪比(S/N=10)对应浓度换算为定量限(LOQ)。结果表明，5个组分的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9995，定量限为1～20 μg/kg，结果见表2。

表2 标准曲线、相关系数和定量限(LOQ)(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients and limits of quantification (LOQ)(n=6)

2.5 方法的回收率与精密度

为了验证方法的可靠性，进行了回收率实验。称取不含激素残留的空白样品进行标准加入回收实验，加入一定量的混合对照品溶液，按1.2方法处理后，平行测定6次，结果见表3。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对24种市售液体乳制品和9种固体乳制品进行了激素含量的测定。经测定，16种液体乳制品中含有孕酮，含量介于1.4 μg/kg与32 μg/kg之间；2种样品检出双烯雌酚和已烯雌酚，含量接近检出限；其它组分未检出。2种固体乳制品中检出孕酮，含量在10 μg/kg 和20 μg/kg之间；其它组分未检出。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the method (n=6)

3 结论

建立了一种可以准确测定乳制品中多种激素的分析方法。结果表明，建立的方法快速、简便、灵敏、准确，能够满足日常样品检测需求。

参考文献：

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