左归丸对糖皮质激素致肾阴虚证的初步实验研究△

张莉莉 郭春荣 朱荣荣 黄文慧 彭垠婷 王 冰

(上海中医药大学教学实验中心中药学院 上海 201203)

肾阴与肾阳都是肾中精气的一部分，肾阴滋养濡润，肾阳温煦蒸化。一方偏虚，便会造成另一方偏盛，从而影响肾气的生成并造成病理变化，如肾阴虚证、肾阳虚证、肾气虚证等[1]。若肾阴不足，则阴不制阳，阳亢内生，虚热内扰，表现为肾阴虚，证见腰膝酸痛，头晕耳鸣，失眠多梦，精泄梦遗、五心烦热、潮热盗汗等。明代医家张景岳《景岳全书·新方八阵》中记载了左归丸一方，方有熟地黄、枸杞、川牛膝、山茱萸、鹿角胶、山药、龟板胶、菟丝子。该方滋阴补肾、填精益髓，常用于肾阴虚诸证，对骨质疏松[2～3]、神经系统[4～5]、血液系统[6～7]、妇科疾病[8～9]及男性生殖[10～11]系统疾病均有一定疗效。

近年来，肾阴虚动物模型主要有甲状腺机能亢进肾阴虚证模型、肾上腺皮质机能亢进肾阴虚证模型、高血压肾阴虚证模型等，其中甲状腺机能亢进肾阴虚证模型是目前阴虚造模最常用的方法。然而成功复制甲亢模型需要的周期较长，例如甲状腺素结合利血平法造模周期为10d，单纯甲状腺素法需要21d[12]，造模周期长使得试验周期相应加长，对时间安排、动物饲养、环境控制等均造成一定困难。本研究通过使用氢化可的松造大鼠肾阴虚模型，给药左归丸考察其对大鼠体重、肾体比及对HPA轴的影响，以期建立起一个造模周期适当、左归丸药效重复性好的肾阴虚模型。

1 材料与仪器

DHG-9003电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Synergy2多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；XS105五位电子天平(梅特勒-托利多国际有限公司)；BS124S电子天平(德国赛多利斯有限公司)；S1352000超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；TDL-50B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SF-400A电子称(永康市龙蓓工贸有限公司)。

清洁级SD大鼠60只，雄性，体重(200±20)g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号SYXK(沪)2014-0008，饲养于上海中医药大学动物实验中心清洁级屏障系统内。

氢化可的松(国药集团化学试剂有限公司，批号20121130，BR级)；肝素钠注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，批号51601114)；左归丸(上海中医药大学自制，批号20150108，由熟地黄、枸杞、川牛膝、山茱萸、鹿角胶、山药、龟板胶、菟丝子配以适当辅料制备而成，每克左归丸含生药2.01g)；六味地黄丸(九芝堂股份有限公司，批号201609018，浓缩丸)；大鼠促肾上腺皮质激素释放激素酶联免疫吸附测定试剂盒(伊莱瑞特生物科技有限公司，批号AK0017APR15019)。本实验所有用到的有机试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，为分析纯；蒸馏水为上海中医药大学教学实验中心自制。

2 方法

2.1 动物分组与给药

按随机分组法[13]将60只清洁级雄性SD大鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、肾阴虚模型组、左归丸低剂量组、左归丸中剂量组、左归丸高剂量组和六味地黄丸组。左归丸推荐剂量以生药计为20.12g/d，将左归丸中剂量设置为推荐剂量，低剂量为其1/2，而高剂量为其两倍。六味地黄丸推荐剂量以生药计为9g/d。按体表面积换算人与动物的等效剂量，换算结果见表1。将左归丸与六味地黄丸分别粉碎过65目筛，用生理盐水配制成药物溶液，大鼠灌胃体积为5 mL/kg体重。左归丸低剂量组、左归丸中剂量组、左归丸高剂量组、六味地黄丸组以表1所示剂量，每日灌胃给药，正常对照组与肾阴虚模型组每日给予1 mL生理盐水灌胃，连续8d。

精密称取2.5g氢化可的松溶于50%乙醇溶液中，配制成5mg/mL溶液。从第5d起，除正常对照组外，每日每组大鼠按体重给予氢化可的松50mg/kg复制大鼠肾阴虚模型，连续造模4d。第8d给药氢化可的松后，各组大鼠禁食不禁水12h，观察各组动物体征变化，采集两侧肾上腺进行肾上腺组织形态学检查，并取血检查血浆促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)水平。

表1 各组动物的治疗给药剂量

组别药物剂量(g·kg-1·d-1，以生药计)正常对照组--肾阴虚模型组--左归丸低剂量组左归丸0．91左归丸中剂量组左归丸1．81左归丸高剂量组左归丸3．62六味地黄组六味地黄丸0．81

2.2 动物采血与血浆CRH水平测定

2.2.1动物采血

动物经腹腔注射2%戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉固定在鼠板上，打开腹腔，用无菌棉球将肠管及其他组织向大鼠一侧腹部擦移并擦去筋膜及脂肪组织，使主动脉充分暴露。取10mL一次性注射器，针尖斜面朝下，约25°向心端刺入主动脉抽吸血液。所取血液立刻加入到肝素钠EP管中，每管约加入1.5mL血液，15min内经3000r/min离心10min，取血浆备用。

2.2.2大鼠血浆CRH水平测定

取CRH标准品，加入标准品和样品稀释液配制成20 ng/mL标准品溶液，再倍比稀释成10、5、2.5、1.25、0.63、0.31ng/mL标准品溶液，取标准品和样品稀释液为空白孔，即0 ng/mL。取大鼠血浆，加入标准品和样品稀释液稀释5倍，备用。

取96孔板加样，每孔50μL，其中20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0 ng/mL标准孔及空白孔各设两空，计算时取两孔度数的平均数。加样后立刻向每孔中加入生物素化抗体工作液50μL，轻轻晃动混匀，给酶标板覆膜，37℃孵育45min。孵育结束后，洗板3次。向每孔中加入酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30min，洗板5次。向每孔加入底物溶液(TMB)90μL，酶标板覆膜37℃避光孵育，每5 min观察一次酶标板显色情况，当标准孔出现明显梯度时，停止孵育。最后向每孔中加入终止液50μL，孔内颜色由蓝色转为黄色，在450nm波长测定各孔的光密度(OD值)并进行计算。

2.3 动物肾上腺采集与组织形态学研究

取血完成后处死动物，取出动物两侧肾上腺，剥离脂肪组织，放入4%甲醛溶液中固定，称重，按公式1计算大鼠肾上腺-体重比例(肾体比)。将固定后的组织脱水、浸蜡、包埋、切片、染色制成病理切片于显微镜下观察。

肾体比(%)=两侧肾上腺总质量/大鼠体重×100%(公式1)。

2.4 数据处理与分析

本实验中所有数据均使用SPSS19.0软件进行统计学分析，当P<0.05时为有显著性差异。

3 结果

3.1 动物体征及体重变化

第1～4d预防性给药过程中，各组大鼠体重平稳增长，体重增长量无显著性差异。第5～8d给药氢化可的松，模型组大鼠体重下降明显、体温升高、活动频度增加、毛色枯槁无光泽、饮水量增多的现象，查阅文献[14]后可知肾阴虚模型造模成功。其中模型组大鼠体重显著性下降(P<0.05)，左归丸低剂量组、中剂量组和六味地黄丸组大鼠体重下降较缓，各组大鼠平均体重情况见表2。

组别第1d(g)第5d造模前(g)第8d(g)正常对照组211．40±9．57239．10±7．12256．40±8．77肾阴虚模型组203．67±14．11226．56±13．44211．11±9．81▲左归丸低剂量组211．11±12．86231．89±15．58216．78±8．12左归丸中剂量组211．60±8．02235．40±10．24222．00±15．08左归丸高剂量组208．70±3．37235．40±7．37215．10±8．98六味地黄组211．00±5．95238．00±6．46222．38±9．27

注：▲与正常对照组比，P<0.05。

3.2 大鼠血浆CRH水平

以CRH浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用curve expert软件拟合作大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)标准曲线(公式2)，如图1，线性范围0.31 ～ 20 ng/mL。

y=(a+bx)/(1+cx+dχ2)，a=3.61×108，b=8.39×108，c=1.23×108，d=1.49×108(公式2)。

图1 大鼠促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)标准曲线

将各组测定的OD值乘以稀释倍数，代入标准曲线得大鼠血浆CRH浓度，结果见表3。与正常对照组相比，肾阴虚模型组大鼠血浆CRH水平显著降低(P<0.05)。与肾阴虚模型组相比，左归丸中剂量组大鼠血浆CRH水平显著升高(P<0.05)。而左归丸低剂量、高剂量组及六味地黄丸组，在CRH平均浓度一项上较肾阴虚模型组高，但并不存在显著性差异(P>0.05)。

3.3 动物肾上腺组织形态学研究

大鼠肾体比计算结果见表4，与正常对照组比，肾阴虚模型组大鼠肾体比显著下降(P<0.05)。在给于药物治疗后，与肾阴虚模型组相比，左归丸组和六味地黄丸组大鼠肾体比均升高，且左归丸高剂量组大鼠肾体比升高显著(P<0.05)。

各组大鼠肾上腺组织切片见图2，正常对照组大鼠肾上腺皮质与髓质清晰可辨，球状带、束状带、网状带的结构明显。肾阴虚模型组大鼠肾上腺皮质明显薄于模型对照组，且皮质与髓质的较难区分。在给药后，肾上腺皮质萎缩情况有所改善，以中剂量的左归丸对肾上腺皮质萎症状的干预情况最好。

组别CRH(ng/mL)正常对照组38．08±11．36肾阴虚模型组27．68±5．03▲左归丸低剂量组30．50±6．05左归丸中剂量组35．12±6．11△左归丸高剂量组31．24±7．59六味地黄组33．29±6．78

注：▲与正常对照组比，P<0.05；△与肾阴虚模型组比，P<0.05。

组别大鼠肾体比(%)正常对照组0．0256±0．0019肾阴虚模型组0．0179±0．0008▲左归丸低剂量组0．0180±0．0017左归丸中剂量组0．0181±0．0010左归丸高剂量组0．0196±0．0027△六味地黄组0．0185±0．0043

注：▲与正常对照组比，P<0.05；△与肾阴虚模型组比，P<0.05。

图2 各组大鼠肾上腺切面图(HE,×100)

注：P1：正常对照组；P2：肾阴虚模型组；P3：左归丸低剂量组；P4：左归丸中剂量组；P5:左归丸高剂量组；P6：六味地黄丸组。

4 讨论

《景岳全书》中记载的左归丸是滋阴名方，由熟地八两、山药抄四两、山茱萸四两、枸杞四两、菟丝子四两、川牛膝熟三两、鹿角胶四两、龟板胶四两经熬制而成。熟地、山茱萸、山药、枸杞补肾填精；龟板胶偏于补阴，鹿角胶偏于补阳，取“阳中求阴”之意，两者峻补精髓；川牛膝“补精填髓，益阴活血”；菟丝子“入肝脾肾三精。补髓填精，助阳固泄[15]。”该方滋阴补肾、填精益髓，常用于肾阴虚诸证。

氢化可的松作为一种糖皮质激素被广泛运用于临床治疗中，有抗炎、抗毒、抗休克等作用，也有一定的盐皮质激素活性。从中医学角度来讲，大剂量使用糖皮质激素，会影响阴精内敛、不能滋养，从而造成肾阴亏虚[16]。然有研究指出阴虚造模必须要密切观察时间，因为证型会随着时间和剂量的改变而发生演变。应用大量糖皮质激素的确会造成实验动物机体的损耗，从而表现去虚损症状，早期以阴虚为主，但如果尝试给予糖皮质激素造模则会使证型由阴虚转向阳虚[17]。杨梦玲[18]曾以50mg/kg体重氢化可的松灌胃5d造动物肾阴虚模型，刘旭光[19]以50mg/kg体重氢化可的松灌胃4d造动物肾阴虚模型，而邹忠杰[20]则以10mg/kg体重氢化可的松腹腔注射15d造肾阳虚模型。

综合考虑糖皮质激素的剂量与时间对造模结果的影响，本实验选择通过短时间内对大鼠使用大剂量氢化可的松，成功复制出大鼠肾阴虚模型。模型组大鼠体重下降明显、体温升高、活动频度增加、毛色枯槁无光泽、饮水量增多的现象，并且出现肾上腺皮质萎缩、血浆CRH水平下降，表明大鼠处于肾阴亏虚状态且下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)轴受到了一定的抑制。在给予药物左归丸治疗后，大鼠血浆CRH水平上升，肾上腺组织病理改变减轻，说明左归丸的干预对大鼠HPA轴产生了一定的保护作用，以左归丸中剂量组治疗效果最为显著。由于机体阴阳平衡的变化是一个长期的过程，因此，建立与临床病症更为一致的造模方法是尚需进一步深入研究的。

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