MicroRNA-21靶调控NCM460细胞ROCK1基因上调occludin表达*

李 超， 刘 敏， 刘志华

(中山大学附属第六医院结直肠外科， 广东省胃肠病学研究所， 广东 广州 510655)

目前肠屏障功能调节的研究主要集中在益生菌及其活性成分、致病菌及相关成分和炎症介质等方面[1-2]，对于其机制的研究仍有一定的局限[3]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)近几年的研究主要集中在肿瘤[4-6]、心血管疾病[7]以及神经系统疾病[8]等，而其对肠屏障功能的影响研究较少[9]。研究表明，miR-21可激活肠上皮细胞内的丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号通路，抑制第10号染色体缺失的磷酸酶-张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号通路，且PTEN/PI3K信号通路活化被认为参与了肠上皮机械屏障的调节[10]。miR-21是否通过其它途径影响肠上皮机械屏障仍不明确。生物信息学分析表明，miR-21的预测靶基因包括Rho蛋白家族中的一些成员，如ROCK1。有研究表明，Rho蛋白家族中ROCK1参与调节紧密连接(tight junction，TJ)相关蛋白——闭合蛋白(occludin)的表达与沉积[11]。肠上皮机械屏障主要包括肠上皮细胞及细胞间紧密连接蛋白，occludin是重要的细胞间紧密连接蛋白。据此，我们假设miR-21可能通过靶向调控ROCK1而调节肠屏障功能相关蛋白occludin。在此基础上，我们拟通过细胞水平上调或下调miR-21观察肠上皮细胞的功能表型改变，进而采用生物信息学方法预测miR-21的靶基因，并通过萤光素酶报告基因进行验证。从而明确miR-21对肠屏障功能的影响，推测可能的机制。

材 料 和 方 法

1 细胞

人正常结肠上皮细胞系NCM460购于INCELL；人胚肾细胞株293T由中山大学附属第六医院胃肠病研究所提供。

2 主要仪器及试剂

NanoDrop 2000超微量分光光度计、CO2培养箱和生物安全柜(Thermo)；ABI 7500荧光定量PCR仪和普通PCR仪(Applied Biosystems)；Model 680酶标仪和蛋白转印系统(BIO-RAD)；DMI4000B自动智能数字相差荧光倒置显微镜(Leica)；G:BOX/HR-E-M自动凝胶成像系统(Syngene)；倒置相差生物显微镜(Nikon)；萤光素酶分析仪(BMG Labtech)。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和DMEM高糖培养基(Gibco)；Lipofectamine 2000 Reagent、Opti-MEM培养基、TRIzol、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、miRNA qPCR Kit、Platinum PCR SuperMix-UDG、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit、PowerUpTMSYBR® Green Master Mix、高保真DNA聚合酶和T4 DNA链接酶(Invitrogen)；兔抗ROCK1、 occludin和β-actin 多克隆抗体(CST)； II抗和Wizard®基因组DNA纯化试剂盒(弗德生物)；Dual-Luciferase Reporter Assay System、EcoR V、NheI、HindIII、EcoR I和DpnI(Promega)；DNA凝胶回收试剂盒(Tiangen)；质粒提取试剂盒(MN)；KOD -Plus- Neo DNA Polymerase(TOYOBO)；miR-21 mimics和inhibitors(广州锐博生物)。所用引物及测序由Invitrogen公司根据设计合成。

3 主要方法

3.1hsa-miR-21慢病毒载体的构建 表达载体pGIPZ的酶切采用BamH I和XhoI完成。对酶切产物电泳，随后回收产物片段，长度约11 kb。扩增目的基因所用引物设计如下，hsa-miR-21-BamH I-R: 5’-ATTCTGATCAGGATCCCTAAGTGCCACCAGACAGAAG-3’；hsa-miR-21-XhoI-F: 5’-CAACAGAAGGCTCGAGGATCTTAACAGGCCAGAAATG-3’；miR30-F: 5’-ATGAGGCTTCAGTACTTTACAG-3’；WPRE-R: 5’-CATAGCGTAAAAGGAGCAACA-3’。随后PCR扩增目的基因片段，将扩增的目的基因与线性载体进行同源重组，再将连接产物与DH5α细胞进行转化，最终获得阳性克隆送测序。最终将包装好的慢病毒感染NCM460细胞，构建稳定转染细胞株，荧光显微镜下观察可见到细胞发出绿色荧光，表示感染成功。

3.2miR-213’UTR载体构建 在NCBI上选取并分析目的基因序列，扩增引物序列如下，ROCK1XhoI： 5’-ccgctcgagGCCTGCTTTCGCCTGCTGTC-3’； ROCK1NotI-R：5’-ataagaatgcggccgcTCTATGGGAGTAGTATTT-

TTATTATTCCAATTG-3’。随后在人基因组上通过PCR 钓取目的基因，再将PCR产物切胶回收并纯化，将连接产物转化，平板选取单克隆提取质粒酶切后送测序，BLAST比对测序结果。采用同样方法构建ROCK1 3’UTR突变载体。

3.3miRNA与目的质粒共同转染NCM460细胞 阳离子脂质体法行细胞转染：转染的前 1 d，将NCM460细胞按照每孔2×104在24孔板上铺板；转染当天，NCM460细胞生长融合度应为50%～60%。转染前1 h弃去旧培养基，PBS洗2次，每孔加入300 μL Opti-MEM培养基，放回CO2培养箱；每孔加入1 μL Lipofectamine 2000，加入Opti-MEM培养基至终体积50 μL，在室温下静置约5 min；每个孔用加入20 μmol/L的miR-21 mimic 1 μL、miR-21 inhibitor 2 μL和0.5 μg质粒，再加入Opti-MEM至总体积50 μL，室温下静置5 min；混匀，室温静置20 min；将转染混合液按每孔100 μL加入24孔板，轻轻混匀孔板；放回细胞培养箱中孵育约5 h后，丢弃原培养基，替换为新鲜的完全培养基。

3.4双萤光素酶报告基因检测 转染48 h后，弃去培养基，PBS洗2次，按每孔100 μL加入PLB(passive lysis buffer)，摇床中轻微振摇，室温15 min后收集细胞裂解液。随后使用萤光素酶分析仪检测荧光强度：设置程序：首先预读2 s，然后读值10 s，LAR II和Stop & Glo® Reagent进样量设定为每次100 μL。分别将已加入细胞裂解液的发光板(每样品20 μL)、Stop & Glo® Reagent和 LAR II放入萤光素酶分析仪中。按照萤光素酶分析仪操作说明书运行程序，读取数值并保存数据。

3.5细胞RNA提取及qPCR TRIzol提取细胞RNA，NanoDrop 2000检测A260、A280及其比值，确定RNA的浓度及纯度。PCR 引物设计通过软件Primer 5并参考相关文献，并在NCBI Primer BLAST进行比对。β-actin 上游引物：5’-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3’；β-actin 下游引物：5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’； ROCK1 上游引物：5’-GGTGGTCGGTTGGGGTATTTT-3’；ROCK1 下游引物：5’-CGCCCTAACCTCACTTCCC-3’；occludin 上游引物：5’-TTGAAAGTCCACCTCCTTACAGA-3’；occludin 下游引物：5’-CCGGATAAAAAGAGTACGCTGG-3’。将提取RNA进行反转录合成cDNA后，按照20 μL反应体系步骤加样，依说明程序进行qPCR反应(严格按照说明书进行)。以β-actin为内参照，每个样本设3个复孔检测。结果用公式2-ΔΔCt计算差异值，以对空白对照组细胞为校正样本，将内参照表达值设为1，其余样本与之相比得出的数值即为差异值。

3.6Western blot 检测蛋白表达水平 收集细胞，采用细胞裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，根据样品蛋白浓度计算上样量，Marker上样3 μL。经SDS-PAGE后，用电转仪转膜至硝酸纤维素膜上。室温5% BSA封闭2 h，I 抗孵育过夜，TBST漂洗3次，加入标记 II 抗稀释液室温孵育1 h，TBST漂洗4次，化学发光显像后分析结果。

4 统计学处理

用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 在NCM460细胞中过表达miR-21后occludin蛋白表达上调

采用miR-21过表达慢病毒转染NCM460细胞，使用嘌呤霉素筛选得到miR-21过表达细胞株，稳定转染的NCM460细胞表达绿色荧光蛋白，可发出绿色荧光。采用qPCR检测各组细胞的miR-21相对表达量，结果显示，miR-21过表达的NCM460细胞株中miR-21的表达量显著高于对照组(P<0.05)，表明miR-21在miR-21过表达NCM460细胞株中的表达显著上调，见图1A。同时采用Western blot检测2组细胞中occludin的蛋白表达水平发现，miR-21过表达细胞株中occludin蛋白的表达显著高于对照组(P<0.01)，提示在NCM460细胞中过表达miR-21可上调occludin蛋白表达，见图1B。

Figure 1. The expression levels of miR-21 and occludin in miR-21-overexpressing NCM460 cells. A: the expression of miR-21 determined by qPCR; B: the result of Western blot for determining the protein level of occludin. Mean±SD.n=3 .*P<0.05vscontrol group.

图1miR-21过表达的NCM460细胞miR-21表达水平及occludin蛋白表达水平

2 miR-21的靶基因预测

根据TargetScan(http://www.targetscan.org/)、 PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)、miRmap(http://mirmap.ezlab.org/)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/)和miRbase(http://www.mirbase.org/)5个数据库预测hsa-miR-21作用的靶基因。通过生物信息学分析，根据不同软件预测的靶基因的差异与miR-21和对应基因3’非编码区配对种子序列的保守性，对靶基因进行打分排序，结果发现Reck、Tgfbi、Ntf3、Arhgap24、Arhgap27、ROCK1、Cdc42和PTEN等靶基因得分较高。同时文献分析表明，Rho激酶相关蛋白家族Rho-ROCK在肠屏障损伤中作用较为明确，而ROCK蛋白为同时作为Rho蛋白的重要底物且ROCK1分布于神经以外组织。因此，拟选取ROCK1作为miR-21的潜在靶基因。

3 在NCM460细胞中过表达miR-21可下调ROCK1的mRNA和蛋白水平

采用miR-21 mimic转染NCM460细胞24 h后用qPCR分别检测miR-21及ROCK1的相对表达水平，结果显示，与对照组相比，miR-21 mimic转染NCM460细胞24 h后miR-21相对表达水平显著升高(P<0.05), 而此时miR-21 mimics转染组ROCK1的mRNA相对水平显著降低(P<0.01), 表明miR-21过表达可在细胞水平显著下调ROCK1的mRNA水平，见图2A、B。48 h后，miR-21 mimics转染组NCM460细胞的ROCK1蛋白表达水平亦显著下调(P<0.01)，见图2C。

Figure 2. The expression levels of miR-21 (A), ROCK1 mRNA (B) and ROCK1 protein (C) in NCM460 cells transfected with miR-21 mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2转染miR-21mimic的NCM460细胞中miR-21和ROCK1mRNA及蛋白的表达水平

4 在NCM460细胞中抑制miR-21可上调ROCK1的mRNA和蛋白水平

采用miR-21 inhibitor转染NCM460细胞24 h后，用qPCR分别检测miR-21及ROCK1的mRNA的相对表达水平，结果显示miR-21 inhibitor转染NCM460细胞24 h后miR-21相对表达水平明显降低(P<0.05), 而此时miR-21 inhibitor转染组ROCK1的mRNA相对水平上升(P<0.05), 表明在NCM460细胞中抑制miR-21表达可在细胞水平显著上调ROCK1的mRNA水平，见图3A。48 h后，miR-21 inhibitor转染组NCM460细胞的ROCK1蛋白表达水平亦显著上调(P<0.01)，见图3B。

Figure 3. The expression levels of miR-21, ROCK1 mRNA (A) and ROCK1 protein (B) in NCM460 cells transfected with miR-21 inhibitor. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

图3转染miR-21inhibitor的NCM460细胞miR-21和ROCK1mRNA及蛋白的表达水平

5 萤光素酶报告基因实验验证ROCK1为miR-21的靶基因

利用miRBase查找miR-21(miR-21-5p)的序列，在NCBI上查询ROCK1的mRNA序列(NM_005406.2)并选取其3’UTR序列部分，将两者采用NCBI的BLAST进行比对，预测miR-21在ROCK1 mRNA的3’UTR上的可能结合序列，结果可见ROCK1 mRNA的3’UTR中42～48 nt含有miR-21的调控位点，见图4A。通过RT-PCR方法将含有该调控位点的片段以及调控位点突变的片段克隆至psiCHECK-2表达载体，在NCM460细胞中过表达miR-21，利用双萤光素酶报告基因实验分析miR-21对调控位点的作用，结果发现miR-21通过调控该位点进而显著影响了报告基因的表达，同时对ROCK1突变3’UTR片段无明显调控作用，证明内源性miR-21可以有效抑制报告基因表达，即ROCK1为miR-21的靶基因，见图4B。

Figure 4.ROCK1 was verified as the target gene of miR-21. A: the predicted binding site of miR-21 on ROCK1 3’UTR; B: dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图4验证ROCK1为miR-21靶基因

讨 论

本课题组既往研究发现，某些miRNA参与了肠道屏障功能的调节[12]。在本研究中，我们提出假说miR-21通过靶向调控ROCK1进而调节TJ相关蛋白occludin，是肠屏障功能的保护因素。为验证假说，我们首先通过体外实验检测miR-21对细胞肠屏障相关表型是否影响加以验证，为此选择了NCM460细胞系作为我们的实验对象。NCM460和FHC细胞等是较为常见的人正常结肠上皮细胞系，可排除肠道肿瘤细胞、未成熟或分化不够的原代上皮或永生化细胞系带来的干扰。通过构建hsa-miR-21过表达慢病毒载体转染NCM460细胞系得到miR-21过表达NCM460细胞，通过qPCR检测发现其miR-21表达情况较对照组显著升高约为对照组的4倍以上，证明miR-21过表达NCM460细胞系构建成功，进而通过Western blot检测其TJ相关蛋白occludin表达情况，结果发现miR-21过表达NCM460细胞其occludin表达上调，与假设一致，说明miR-21能够上调TJ蛋白表达进而维持肠屏障正常功能。该实验存在一定的局限性，一是未构建miR-21抑制表达细胞系，二是只检测了主要的TJ蛋白，其它TJ蛋白以及肠上皮细胞凋亡情况未进行检测。针对第一点，后续我们将通过在体实验进一步补充完善。Occludin是经典的肠上皮细胞间紧密连接蛋白，在肠屏障功能维持方面起了较为重要重要的作用，其它的TJ蛋白还有ZO-1、ZO-2和ZO-3，20种异构体以上的claudin蛋白以及其它一些非典型蛋白。进一步通过生物信息学分析与文献查找，选取ROCK1作为miR-21的靶基因进行下一步研究。生物信息学分析方法可参考前述。miRNA的调控特点是“多对多”，事实上生物信息学方法可以预测出相当数量的靶基因，而动物miRNA的互补程度低，因此程序算法的预测结果理论上也会较多。结合打分情况，我们发现Rho-ROCK蛋白家族[13]在预测结果中出现概率较高，包括(1)Rho-GTP酶超家族成员：Rho、Rac以及Cdc42等；(2)GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein, GAP)：Arhgap22和Arhgap24等；(3)Rho亚家族下游效应分子：Rho激酶1即ROCK1。GAP是Rho-GTP酶的负调因子，通过加速Rho-GTP酶水解，使其失活。参与Rho-GTP酶活性调节的还有：鸟苷酸交换因子(guanine-nucleotide exchanging factors，GEFs)以及GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor，GDI)，其中前者为正向调节，后者为负向调节抑制Rho-GTP酶活性。而ROCK1作为Rho蛋白家族的下游底物，显然其作用较为明确，而ROCK的底物包括肌球蛋白轻链以及内收蛋白[11]等，参与细胞骨架调整、细胞收缩和肿瘤细胞浸润，同时参与了微管以及F-actin的极化调节[14]。有研究证实ROCK通过影响IECs的F-actin结构引起肠上皮通透性增加，也有研究发现Rho信号通路的激活通过磷酸化肌球蛋白，可使肠上皮细胞间TJ蛋白ZO-1及occludin发生改变，继而引起肠屏障通透性增加与功能紊乱[15]。因此，我们选取ROCK的异构体ROCK1作为miR-21的靶基因进行研究。通过在细胞水平转染miR-21 mimic及inhibitor上调和下调NCM460细胞系的miR-21水平，qPCR及Western blot检测发现miR-21过表达引起ROCK1的mRNA降解，蛋白水平表达下调；相反miR-21表达抑制引起ROCK1 mRNA与蛋白表达上调，可以看出miR-21能影响ROCK1的表达。为确定其是否为miR-21的靶基因，我们采用萤光素酶报告基因实验进行验证，发现相比较于转染克隆有ROCK1突变型3’UTR的序列，在转染克隆有野生型ROCK1 3’UTR质粒中，miR-21组的萤光素酶相对活性较对照组低。因此我们得出结论，miR-21在细胞水平对肠屏障的结构起到维持作用，而ROCK1是miR-21的靶基因，miR-21可能通过Rho-ROCK1通路进而影响肠屏障相关蛋白occludin的表达。

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