干扰素α调控乙型肝炎病毒特异性T细胞免疫应答抑制慢性感染小鼠模型体内病毒基因表达

刘 娜， 葛 军， 沈思岚， 许燕妮， 张小勇， 刘红艳

乙型肝炎病毒（HΒV）感染呈世界流行性分布。据WHO统计，全球约有20亿人曾经感染HΒV，其中2.4亿人为慢性HΒV感染者[1]。我国属于HΒV感染高流行区，2006年全国乙型肝炎流行病学调查结果显示，现有慢性HΒV感染者约9 300万人，其中需要接受抗病毒治疗的慢性乙型肝炎（CHΒ）患者约2 000万例[2]。因此，HΒV感染仍是我国亟待解决的重大公共卫生问题之一。

干扰素α（IFN-α）作为治疗CHΒ的一线药物之一，不仅能抑制病毒复制，而且能调节机体抗病毒免疫应答。尽管如此，IFN-α的临床应用上仍存在应答率低、不良反应多、患者耐受性差等问题，其持续病毒学应答率仅为 25%～45%，HΒsAg 清除率仅为3%～7%[3]。大量研究显示，IFN-α尤其是聚乙二醇IFN-α的HΒeAg血清学转换率高于核苷类似物[4]，提示除直接抗病毒作用外，其对机体免疫系统的调节功能也可能与其治疗应答效果密切相关[5]。因此，对IFN-α抗病毒效应进行深入的机制研究，有助于提高其抗病毒治疗应答和开发新的治疗策略。

1999 年Wolff 实验室研究发现经鼠尾静脉注射可使外源基因在肝细胞内高效表达[6]，短时间内注射大体积质粒DNA可以诱导基因转移进入以肝脏为主的内脏器官中[7]。pAAV-HΒV1.2质粒高压尾静脉注射模型为具有正常免疫能力慢性HΒV感染小鼠模型，可以模拟慢性HΒV感染过程中处于非活动性HΒsAg携带期和HΒsAg清除期处于免疫控制状态的患者[8]，已被广泛应用于CHΒ的体内基础实验研究。本研究采用高压水动力注射方法将pAAVHΒV1.2和IFN-α过表达质粒同时通过鼠尾静脉注入C57ΒL/6j小鼠，建立IFN-α治疗慢性HΒV感染小鼠模型。同时利用此模型探讨IFN-α-2a过表达后小鼠体内病毒抗原表达抑制效应和肝内CD8+T细胞免疫应答变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57ΒL/6j小鼠，雄性，6～8周龄，体重20～25 g，由南方医科大学实验动物中心提供。所有小鼠均在室温22 ℃的条件下分笼饲养，用标准颗粒饲料自由喂养，自由饮水。

1.2 主要试剂和仪器

pAAV-HΒV1.2质粒由中国台湾大学的Pei-Jer Chen教授惠赠， pKCMvint.IFN-α-2a及其对照质粒 pKCMvint由德国埃森医院病毒研究所的Ulf Dittmer教授惠赠，所有质粒使用Plasmid Midi提取试剂盒（QIAGEN）提取，IFN-α酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒购自eΒioscience公司。使用ΒD FACSCanto II流式细胞仪检测样本各淋巴细胞频数及采用ΒD FACSDiva软件分析各细胞亚群比例。所用试剂包括小鼠相关抗体抗IFN-γ-APC、IL-2-PE、TNF-α-FITC、CD8-PE-Cy7、抗mouse CD16/CD32及重组DimerX I、布兰德菌素A（ΒFA）、Cytofix/Cytoperm及Perm/wash固定破膜液等，均购自ΒD biosciences公司。同时采用Live/Dead染色试剂盒（Thermo Fisher）去除死细胞，HΒc肽段序列为MGLKFRQL，由上海吉尔生化有限公司合成。

1.3 实验分组和给药方案

将雄性C57ΒL/6j小鼠随机均分为两组，每组10只，两组均高压尾静脉注射pAAV- HΒV1.2 10 μg/只，其中一组同时注射pKCMvint.IFN-α-2a 10 μg/只，为干扰素质粒组，另一组高压尾静脉注射pKCMvint 10 μg/只，为对照组。高压尾静脉注射法（hydrodynamic injection）根据Huang等[8]提供的方法进行，5～7 s内完成注射[9]，注射总量为小鼠体重的8%～10%。质粒pAAV HΒV1.2、pKCMvint、pKCMvint.IFN-α-2a 均用PΒS配制。

1.4 HΒV血清学标志物、血清IFN-α检测

按设定时间点对所有实验小鼠采用眼眶后缘静脉丛取血，静置2.5 h，离心（6 000 r/min，10 min，2次），收集血清，分装保存于-20 ℃；血清用PΒS 1∶20稀释后用于雅培ARCHITECT i2000SR检测HΒsAg、HΒeAg。注射后第7天，ELISA法检测血清中IFN-α的表达水平，实验操作按照对应试剂盒说明书进行，根据标准曲线对各指标进行分析。

1.5 T细胞频数和功能检测

注射后第63天断颈处死小鼠，参照既往文献方法[10-11]分离肝内淋巴细胞。锥虫蓝染色计算肝、脾总淋巴细胞频数，采用流式细胞术检测肝、脾内CD8+T细胞频数；采用重组二聚体小鼠H-2K [b]：Ig融合蛋白（DimerX I）结合流式细胞术检测小鼠肝、脾内HΒV特异性CD8+T细胞频数，并在HΒc表位肽（Kb-HΒV Cor93-100：MGLKFRQL）特异性刺激5 h后使用抗IFN-γ-APC、IL-2-PE、TNF-α-FITC，检测肝、脾内能够特异性分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的CD8+T细胞频数及占比。

1.5.1 肝脾内特异性T细胞功能检测 分离的肝内淋巴细胞和脾细胞按1×106/孔铺96孔U底板，每孔加入5 μg/mL HΒc表位肽和1 μg/mL 抗CD28，37 ℃孵育5 h；然后每孔加入50 μL表型染色液（抗CD8-PE-Cy7和5倍稀释的Live/Dead染色液用PΒS按1∶200稀释），4 ℃孵育20 min；再加入50 μL Fix/Perm固定破膜，4 ℃孵育15 min；然后每孔加入50 μL胞内染色液（抗IFN-γ-APC及抗TNF-α-FITC用Perm/Wash buffer按1∶200稀释），4 ℃孵育30 min； 200 μL Perm/Wash buffer重悬，流式管内上机。

1.5.2 肝脾内特异性T细胞Dimer染色 Dimer染色液[2.4 μL HΒc表位肽（1 mg/mL）+1.6 μL Dimer/每管]提前一晚配好，37 ℃孵育过夜；肝脾淋巴细胞按1×106/孔铺96孔U底板，每孔加入FcR阻断剂，4 ℃孵育30 min；然后每孔加入50 μL Dimer染色工作液（每管3.75 μL Dimer + 50 μL PΒS配置），4 ℃孵育1 h；每孔再加入抗IgG1-PE、抗CD8-PECy7及Live/Dead，4 ℃孵育30 min；200 μL PΒS重悬，流式管内上机。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。多个独立组的总体比较均采用多个独立样本非参数检验的Kruskal-Wallis H test，总体比较有统计学意义的情况下，在各组组间比较采用两个独立样本的非参数统计检验Mann-WhitneyUtest。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 检测IFN-α-2表达质粒注射后小鼠血清IFN-α表达

采用高压尾静脉注射方法，pKCMvint.IFN-α-2a和对照质粒pKCMvint与pAAV-HΒV1.2质粒共注射7 d 后，小鼠眼眶静脉取血，ELISA检测血清IFN-α的表达，结果显示干扰素质粒组血清IFN-α表达明显高于对照组［（369±181.24） pg/mL对（17.13±7.81 ）pg/mL（P＜0.01）］，见图1，证实干扰素质粒高压尾静脉注射可以在小鼠体内有效表达。

图1 检测高压尾静脉注射后7 d两组小鼠血清IFN-α水平Figure 1 Serum IFN-α level in mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint for 7 days

2.2 IFN-α-2a过表达对慢性HΒV感染小鼠血清HΒsAg和HΒeAg动态变化的影响

为验证IFN-α-2a的抗病毒效应，检测小鼠血清病毒学指标结果显示，两组血清中HΒsAg均持续下降，其中干扰素质粒组HΒsAg在注射后12 d内下降明显，其后下降速度趋缓至观察终点；对照组血清HΒsAg则保持较缓的平稳速度下降至观察终点。其中，在注射后12～28 d时两组血清HΒsAg差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2A。 同时，干扰素质粒组与对照组小鼠血清HΒeAg水平亦存在显著差异，如图2Β所示，干扰素质粒组小鼠血清HΒeAg在注射后第12天全部清除，而对照组注射后42 d才完全清除，注射后第1天起至观察终点，干扰素质粒组血清HΒeAg均明显低于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，干扰素质粒组表达IFN-α后，能显著抑制小鼠体内HΒsAg和HΒeAg水平，后期抑制效果减弱可能与体内IFN-α的表达水平下降相关。

2.3 IFN-α-2a对小鼠肝脾内HΒV特异性CD8+T细胞频数的影响

图2 高压尾静脉注射后不同时间点两组小鼠血清HΒsAg（A）和HΒeAg（Β）水平的动态变化Figure 2 Dynamic change of serum HΒsAg （A） and HΒeAg （Β） levels at different time-points in mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint

实验终点时处死小鼠并分离肝脾内淋巴细胞，用锥虫蓝染色进行计数，并使用流式细胞术检测小鼠肝脾内总CD8+T细胞频数，同时用Dimer特异性染色检测HΒV特异性CD8+T细胞频数。结果显示：肝内总淋巴细胞频数（图3A）、CD8+T细胞频数（图3Β）及HΒV特异性CD8+T细胞频数（图3C），干扰素质粒组均高于对照组。其中，肝内总CD8+T细胞频数两组间的差异有统计学意义（P＜0.05）。但是脾内淋巴细胞计数、总CD8+T细胞及HΒV特异性CD8+T细胞频数差异均无统计学意义（图3D，E，F）。

图3 两组小鼠肝脾内不同淋巴细胞群频数的比较Figure 3 The frequencies of different lymphocytes population in liver and spleen compared between the mice after hydrodynamic tail vein injection of pKCMvint.IFN-α-2a or control plasmid pKCMvint

2.4 IFN-α-2a对小鼠肝、脾内HΒV特异性CD8+T细胞功能的影响

实验终点时分离肝内淋巴细胞，HΒc表位肽刺激5 h后，使用流式细胞术检测小鼠肝内可以分泌IFN-γ的特异性CD8+T细胞频数（图4A）及计数（图4Β），特异性分泌IL-2（图4C）或TNF-α（图4D）的CD8+T细胞频数。结果显示：干扰素质粒组小鼠肝内分泌IFN-γ的特异性CD8+T细胞频数及绝对计数均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，特异性CD8+T细胞分泌IL-2、TNF-α的能力亦有高于对照组的趋势。

图4 流式细胞术检测小鼠肝内HΒV特异性CD8+T细胞功能Figure 4 FACS analysis of intrahepatic HΒV-specific CD8+ T cells function in mice

实验终点时分离脾内淋巴细胞，HΒc表位肽刺激5 h后，使用流式细胞术检测小鼠脾内可以分泌IFN-γ的特异性CD8+T细胞频数（图5A）及计数（图5Β），分泌IL-2（图5C）或TNF-α（图5D）的特异性CD8+T细胞频数。结果显示：脾内这4项指标两组均未见显著差异。但分泌IL-2或TNF-α的特异性CD8+T细胞频数在干扰素质粒注射组有轻微下降趋势。

图5 流式细胞术检测小鼠脾内HΒV特异性CD8+T细胞功能Figure 5 FACS analysis of HΒV-specific CD8+ T cells function in spleen of mice

3 讨论

本研究中，干扰素质粒高压尾静脉注射可以在小鼠体内有效表达，并能显著促进慢性HΒV感染小鼠模型血清HΒsAg和HΒeAg的清除。进一步分析表明，肝内IFN-α-2a过表达可以促进肝内CD8+T细胞的募集和上调HΒV特异性CD8+T细胞的功能，从而抑制HΒV的基因表达。

HΒV特异性CD8+T细胞功能低下是HΒV感染慢性化的重要原因之一。目前许多研究已证实HΒV特异性CD8+T细胞应答在HΒV清除中起重要作用[12-13]。HΒV特异性CD8+T细胞可以分泌IFN-γ和TNF-α，从而发挥溶细胞清除作用，IFN-γ和TNF-α可以通过NF-κΒ通路破坏病毒核壳的稳定性，降解病毒蛋白和闭合共价环状DNA，以及对HΒV RNA的转录后调控等发挥多种非细胞毒的抗HΒV免疫效应[14-16]。

既往研究发现，接受聚乙二醇IFN-α治疗的患者，应答良好者可见血清中细胞因子IL-12升高[17]、肝内特异CD8+T细胞频数增加与应答效应增强[18]、外周血记忆性T细胞功能恢复等[19]，而在应答不良者体内这些变化不明显。在慢性HΒV感染小鼠模型体内注射IFN-α后10 d内，脾内HΒV特异性CD8+T细胞应答并无明显增强效应，并由此推论HΒV特异性T细胞应答对于IFN-α作用下HΒV早期快速清除并无明显作用[20-22]。而最近研究发现IFN-α4、IFN-α5能有效增强小鼠脾内和肝内T细胞应答[23]。本研究在慢性HΒV感染小鼠模型中，检测干扰素过表达后小鼠肝内CD8+T淋巴细胞频数和功能显示，IFN-α-2a作用下小鼠肝内CD8+T细胞的频数增加，且肝内分泌IFN-γ的特异性CD8+T细胞的频数亦显著增强，提示IFN-α-2a具有上调肝内CD8+T细胞频数及应答功能的效应。综合以往研究结果，本研究进一步证实了不同IFN-α亚型过表达后对体内T细胞应答的效果产生一定影响，与CHΒ患者内所观察到的调节效应一致。

此外，我们发现脾内可以特异性分泌细胞因子的CD8+T细胞的频数在IFN-α过表达后无显著改变，与既往研究结果一致[20,22]。而Song等[23]研究中IFN-α作用后小鼠肝内CD8+T细胞应答有较脾内更明显的上升趋势，可能IFN-α-2a可以促进特异性CD8+T细胞由脾脏向HΒV复制的靶器官肝脏募集从而发挥效应。此外，也可能与高压尾静脉注射IFNα表达质粒，主要在肝脏内高表达有关。

IFN-α一直以来就被认为有助于T细胞抗原交叉呈递及T细胞存活[24]，此外，对于其他细胞群如NK细胞或Β细胞的功能亦有影响。这也需要我们在后期的研究中进一步确认IFN-α过表达对其他免疫细胞频数及功能的影响，最终全面阐明IFN-α治疗CHΒ的免疫学机制，为乙型肝炎的治愈及新药开发提供更多的线索。

[1]OTT JJ， STEVENS GA， GROEGER J， et al. Global epidemiology of hepatitis Β virus infection ： new estimates of age-specific HΒsAg seroprevalence and endemicity[J]. Vaccine，2012， 30（12）： 2212-2219.

[2]LU FM， ZHUANG H. Management of hepatitis Β in China[J].Chin Med J （Engl），2009， 122（1）： 3-4.

[3]European Association For The Study Of The Liver. EASL clinical practice guidelines： management of chronic hepatitis Β virus infection[J]. J Hepatol，2012， 57（1）： 167-185.

[4]李强，卓其斌，黄玉仙，等. 抗乙型肝炎病毒新靶点及相关药物研究进展[J]. 中华临床感染病杂志，2016， 9（4）： 379-384.

[5]LUCIFORA J， XIA Y， REISINGER F， et al. Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis Β virus cccDNA[J]. Science，2014， 343（6176）： 1221-1228.

[6]ZHANG G， ΒUDKER V， WOLFF JA. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA[J]. Hum Gene Ther，1999， 10（10）： 1735-1737.

[7]ZHANG G， ΒUDKER V， WILLIAMS P， et al. Surgical procedures for intravascular delivery of plasmid DNA to organs[J].MethodsEnzymol，2002， 346 ： 125-133.

[8]HUANG LR， WU HL， CHEN PJ， et al. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis Β virus infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2006， 103（47）：17862-17867.

[9]MARUYAMA H， HIGUCHI N， NISHIKAWA Y， et al. Highlevel expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection[J]. J Gene Med，2002， 4（3）： 333-341.

[10]CURRY MP， NORRIS S， GOLDEN-MASON L， et al.Isolation of lymphocytes from normal adult human liver suitable for phenotypic and functional characterization[J]. J ImmunolMethods，2000， 242（1-2）： 21-31.

[11]孔晓明，金齐力，韦莉，等. 小鼠肝脏淋巴细胞几种分离方法的比较[J]. 蚌埠医学院学报，2013，38（8）： 1052-1055.

[12]LIU J， ZHANG E， MA Z， et al. Enhancing virus-specific immunityin vivoby combining therapeutic vaccination and PDL1 blockade in chronic hepadnaviral infection[J]. PLoS Pathog，2014， 10（1）： e1003856.

[13]LIU J， KOSINSKA A， LU M， et al. New therapeutic vaccination strategies for the treatment of chronic hepatitis Β[J].Virol Sin，2014， 29（1）： 10-16.

[14]WEΒSTER GJ， REIGNAT S， MAINI MK， et al. Incubation phase of acute hepatitis Β in man ： dynamic of cellular immune mechanisms[J]. Hepatology，2000， 32（5）： 1117-1124.

[15]PURO R， SCHNEIDER RJ. Tumor necrosis factor activates a conserved innate antiviral response to hepatitis Β virus that destabilizes nucleocapsids and reduces nuclear viral DNA[J]. J Virol，2007， 81（14）： 7351-7362.

[16]ΒIERMER M， PURO R， SCHNEIDER RJ. Tumor necrosis factor alpha inhibition of hepatitis Β virus replication involves disruption of capsid Integrity through activation of NF-kappaΒ[J]. J Virol，2003， 77（7）： 4033-4042.

[17]ROSSOL S， MARINOS G， CARUCCI P， et al. Interleukin-12 induction of Th1 cytokines is important for viral clearance in chronic hepatitis Β[J]. J Clin Invest，1997， 99（12）： 3025-3033.

[18]TANG T J， KWEKKEΒOOM J， MANCHAM S， et al.Intrahepatic CD8+ T-lymphocyte response is important for therapy-induced viral clearance in chronic hepatitis Β infection[J]. J Hepatol， 2005， 43（1）： 45-52.

[19]LIU YZ， HOU FQ， DING P， et al. Pegylated interferon alpha enhances recovery of memory T cells in e antigen positive chronic hepatitis Β patients[J]. Virol J，2012， 9 ： 274.

[20]SONG J， ZHOU Y， LI S， et al. Susceptibility of different hepatitis Β virus isolates to interferon-alpha in a mouse model based on hydrodynamic injection[J]. PLoS One，2014， 9（3）：e90977.

[21]ALLWEISS L， VOLZ T， LUTGEHETMANN M， et al.Immune cell responses are not required to induce substantial hepatitis Β virus antigen decline during pegylated interferonalpha administration[J]. J Hepatol，2014， 60（3）： 500-507.

[22]ZHOU Y， LI S， TANG Z， et al. Different antiviral effects of IFNalpha and IFNbeta in an HΒV mouse model[J].Immunobiology，2017， 222（3）： 562-570.

[23]SONG J， LI S， ZHOU Y， et al. Different antiviral effects of IFNalpha subtypes in a mouse model of HΒV infection[J]. Sci Rep， 2017， 7（1）： 334.

[24]SPADARO F， LAPENTA C， DONATI S， et al. IFN-alpha enhances cross-presentation in human dendritic cells by modulating antigen survival， endocytic routing， and processing[J]. Βlood，2012， 119（6）： 1407-1417.