绿豆酸浆中淀粉絮凝菌的分离鉴定及其生长特性

刘黎莹,许云贺,叶 青,张莉力,*

(1.锦州医科大学食品科学与工程学院,辽宁锦州 121001; 2.锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州 121001)

酸浆是将甘薯或绿豆磨碎成淀粉乳后放置一段时间,经微生物自然发酵,形成的一种淡黄色或乳白色的液体[1]。在绿豆淀粉或甘薯淀粉生成过程中兑入酸浆,淀粉颗粒会迅速凝集变大,形成大的絮凝团,迅速沉降下来。所以,酸浆实际上发挥了絮凝剂的作用,加速绿豆或甘薯淀粉的沉降,使之与蛋白质、纤维等杂质的快速分离。但是,由于酸浆是自然发酵的产物,酸浆质量受自然环境、人为因素等影响大,造成酸浆的絮凝活性非常不稳定[2-3],使得有时出现淀粉不能快速沉淀,或者生产出来的淀粉发暗、发酸等现象,生产出的淀粉的质量不稳定。这些原因导致了酸浆法生产淀粉的规模小,生产的淀粉品质不稳定,且难以进行大规模的工业化生产。

已有研究表明,正是酸浆中的微生物发挥了促淀粉絮凝的作用[4-7]。刘文菊等[8]研究了绿豆酸浆絮凝淀粉的作用机理并对利用酸浆法提取的淀粉性质进行研究,同时研究了用海藻酸钠凝胶包埋乳酸乳球菌沉淀绿豆淀粉的工艺;张莉力等[7，9-10]从甘薯酸浆中分离出13株乳酸菌菌株,筛选出2株具有沉淀淀粉能力的乳酸菌[8-10]。

本研究以自然发酵绿豆酸浆为研究对象,利用平板分离法对酸浆中的微生物进行分离,并以絮凝活性为指标,筛选出一株生长稳定对绿豆淀粉有高絮凝活性的菌株，对该菌株进行鉴定及培养条件优化,为酸浆法在绿豆淀粉生产工业中的规模化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

自然发酵绿豆酸浆 锦州医科大学食品微生物实验室自然发酵获得;绿豆 市售食用级;绿豆淀粉 衡水福桥淀粉有限公司;H2O2、H2S、蔗糖、葡萄糖、乳糖、K2HPO4、醋酸钠、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、尿素、硫酸铵、氯化铵 均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;酵母膏、牛肉膏、琼脂 北京奥博星生物技术有限责任公司;AxyPrep细菌基因组DNA小量制备试剂盒、AP-MN-BT-GDNA-50 Axygen;DNA凝胶回收试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNAmarker 上海桑尼生物科技有限公司。

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 上海苏净实业有限公司;LRH-350F生化培养箱 上海捷呈实验仪器有限公司;HZQ-F200型振荡培养箱 上海华邻实业有限公司;TG16K-II台式高速离心机 济南福的机械有限公司;PHS-3B精密pH计 上海雷磁仪器厂;UV754PC紫外分光光度计 上海佑科仪表有限公司;OLYMPUS BX53显微镜 奥林巴斯(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 绿豆水的制备:取100 g绿豆加蒸馏水至1000 mL,加热煮沸20 min,用120目的筛子过滤,即得1000 mL的绿豆水。

绿豆汁培养基:酵母膏5 g、K2HPO42 g、葡萄糖20 g、乳糖2 g、醋酸钠5 g、绿豆水1000 mL,调pH至6.8,115 ℃灭菌30 min。

固体绿豆汁培养基:在绿豆汁培养基的基础上,加入20 g琼脂,加热溶解后,115 ℃灭菌30 min。

绿豆汁斜面培养基:将加入20 g琼脂的绿豆汁培养基加热溶解后,取3 mL左右加入到试管中,115 ℃灭菌30 min后,取出,趁热倾斜一定角度摆放在操作台上冷却。

种子培养液:酵母膏0.5 g、K2HPO40.2 g、葡萄糖2 g、乳糖0.2 g、醋酸钠0.5 g、绿豆水100 mL,调pH至6.8,分装到试管和三角瓶中,115 ℃灭菌30 min。从斜面上挑取一环菌中接种到试管中,30 ℃培养24 h。然后按10%的接种量接种到三角瓶中,30 ℃培养48 h后,按上述步骤将绿豆汁培养液接种到另一个三角瓶中,30 ℃培养48 h。

1.2.2 菌株的分离与筛选 用无菌生理盐水将自然发酵的绿豆酸浆进行10倍梯度稀释,取10-5、10-6、10-7稀释度的稀释液各1 mL,分别注入至无菌绿豆汁固体培养基中,每个稀释度做两个重复。待培养基凝固后,倒置于30 ℃温箱中培养24～48 h。挑取平板上的单菌落划线接种于固体绿豆汁培养基平板中,30 ℃培养24 h,反复纯化3代。选取平板上表面光滑有光泽低凸边缘扩展整齐的单个小菌落20株对其进行镜检,挑选出10株纯度高、杂菌少、杆状或球状的菌落。再将挑选出的菌落接种到绿豆汁培养基中,30 ℃培养48 h,然后分别测定绿豆汁培养液的絮凝率。选出5株对绿豆淀粉有沉降作用的菌株接种于绿豆汁培养基中,30 ℃培养48 h后,测定5株菌的絮凝率,挑选出絮凝率最高的。

1.2.3 绿豆淀粉沉降速度(絮凝率)的检测方法 在25 mL刻度试管中加入25 mL 2.5%的绿豆淀粉乳溶液之后,加2.5 mL空白绿豆汁培养基溶液,在密封情况下上下摇动,混匀10次,沉淀3 min,取刻度试管的20 cm处溶液为样品,测定600 nm处吸光值计为A;同样方法在25 mL刻度试管中加入25 mL 2.5%的绿豆淀粉乳溶液之后加入2.5 mL菌液,密封情况下上下摇动,混匀10次,沉淀3 min取刻度试管的20 cm处溶液为样品,测定600 nm处吸光值计为B。絮凝率的计算公式为[11-13]:

1.2.4 菌种的鉴定

1.2.4.1 菌种的形态特征观察 将分离到的菌株于绿豆汁固体培养基上30 ℃培养48 h,观察菌落形态,挑取单菌落涂片,进行革兰氏染色镜检。

1.2.4.2 菌种的生理生化实验 参照《伯杰细菌鉴定手册》对该菌进行运动性实验、H2S实验、硝酸盐还原实验、碳源利用实验。

1.2.4.3 16S rDNA的基因序列测定和系统发育分析 正向引物向引物P1(27F):5′-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3′,反向引物P2(1492R):5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增条件:95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s,35次循环,72 ℃ 7 min。PCR扩增和测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。测序结果在GenBank中进行BLAST比对。选取同源性比较高的典型菌株的16S rDNA基因序列作为参比对象,然后用CLUSTAL X软件和MEGA5.0软件进行多序列比对和构建目标菌株与参比菌株之间的系统进化树[14-16]。

1.2.5 菌体生长条件的研究

1.2.5.1 碳源种类对菌体生长的影响 分别选择葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇作为绿豆汁培养基的碳源,添加量为1%,培养基初始pH6.8,115 ℃灭菌30 min,冷却后加入菌种，10%接种量,30 ℃培养48 h,以菌体浓度即OD600值为指标,确定碳源对菌体生长的影响。

1.2.5.2 碳源添加量对菌体生长的影响 以葡萄糖作为绿豆汁培养基的碳源,添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,培养基初始pH6.8,115 ℃灭菌30 min,冷却后加入菌种，10%接种量,30 ℃培养48 h。以菌体浓度即OD600值为指标,确定碳源添加量对菌体生长的影响。

1.2.5.3 氮源种类对菌体生长的影响 分别以尿素、硫酸铵、氯化铵、酵母膏、牛肉膏作为绿豆汁培养基的氮源,添加量为1%,培养基初始pH调节为6.8,115 ℃灭菌30 min。冷却后加入菌种，10%接种量,冷却后加入菌种，30 ℃培养48 h。以菌体浓度即OD600值为指标,确定氮源对菌体生长的影响。

1.2.5.4 氮源添加量对菌体生长的影响 分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的牛肉膏作为绿豆汁培养基的氮源,培养基初始pH调节为6.8,115 ℃灭菌30 min,冷却后加入菌种，10%接种量,30 ℃培养48 h,以菌体浓度即OD600值为指标,确定氮源添加量对菌体生长的影响。

1.2.5.5 不同初始pH对菌体生长的影响 在以1%葡萄糖作碳源,以2%牛肉膏作氮源的绿豆汁培养基中,分别用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液调节培养基的pH至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0,115 ℃灭菌30 min,冷却后加入菌种,10%的接种量,30 ℃下分别培养24、48、72 h,以菌体浓度即OD600值为指标,研究适宜的初始pH。

1.2.5.6 不同培养温度对菌体生长的影响 在以1%葡萄糖作碳源、以2%牛肉膏作氮源、初始pH为5.0的绿豆汁培养基中,115 ℃灭菌30 min,冷却后加入菌种，10%的接种量,分别在15、20、25、30、35、40、45 ℃下培养24、48、72 h,以菌体浓度即OD600值为指标,确定菌体最适生长温度。

1.2.5.7 菌体生长曲线的测定 在上述单因素实验所得适宜培养条件下,按10%的接种量将种子培养液接种到绿豆汁培养基中。采用平板菌落计数法,每隔3 h测定一次培养液的活菌数,然后以菌落数的对数值作纵坐标,以培养时间作横坐标作出醋酸杆菌LLY11的生长曲线[17]。

1.3 统计分析

数据统计采用SPSS 19.0 进行ANOVA单因素方差分析及多重比较LSD(p<0.05),数值以均值±标准误差表示[18-20]。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选

由表1可知,菌株LLY11 对淀粉的絮凝率最高,且传代5次之后絮凝活性仍然较高,絮凝率无明显的下降,因此,选用该菌株作为后续实验的研究对象。

表1 由绿豆酸浆分离出的5株菌对淀粉的絮凝率Table 1 Isolated from five strains of mung bean sour liquid starch flocculating rate

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 形态特征 菌株LLY11个体大小为(0.8～1.2 μm)×(1.5～2.5 μm),革兰氏阴性菌,细胞呈椭圆或短杆状,细胞分裂后呈链状排布、无芽孢、不能运动。菌落大小为2～3 mm,菌落形态为菱形,颜色为乳黄色、不透明、表面光滑有光泽低凸且边缘扩展整齐。

2.2.2 生理生化特征 菌株LLY11生理生化实验结果见表2,参照《伯杰细菌鉴定手册》,初步判断菌株LLY11为醋酸杆菌属。

表2 菌株LLY11生理生化实验结果Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain LLY11

2.2.3 16S rDNA序列分析结果及系统发育树的构建 经16S rDNA鉴定,菌株LLY11的16S rDNA序列全长为1411 bp,经Genbank比对与Acetobacterindonesiensis相似性达到99%。利用CLUSTAL X软件和MEGA5.0软件构建系统发育树,菌株LLY11与Acetobacterindonesiensisstrain 7120034亲缘关系最近,结果如图1所示。

图1 LLY11菌株基因序列系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree constructed gene sequence diagram of LLY11

结合其菌体的群体形态特征、个体形态特征、生理生化实验结果及菌株的16S rDNA序列比对,确定菌株LLY11为醋酸杆菌,命名为AcetobacterindonesiensisLLY11,并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 7480。

2.3 培养条件的研究

2.3.1 不同碳源对菌体生长的影响 碳源对菌体生长影响的实验结果见图2。由图2可知,以葡萄糖作碳源的发酵液菌体OD600值最高,为0.785,所以选择葡萄糖作为培养基的碳源。

图2 不同碳源对菌体浓度的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on cell concentration

2.3.2 碳源添加量对菌体生长的影响 由图3可知,葡萄糖添加1.0%时,菌体OD600值最高为0.877,所以葡萄糖的添加量确定为1.0%。制作培养基时,绿豆经过20 min的煮沸后,绿豆本身含有的淀粉等糖类物质会溶于培养基中,可以作为碳源被菌体所利用,因此使得在培养基中不需要添加较大量的葡萄糖作碳源,菌体也能够达到最高生长量。

图3 碳源添加量对菌体浓度的影响Fig.3 Effect of carbon source addition on cell concentration

2.3.3 不同氮源对菌体生长的影响 由图4可知,添加牛肉膏的菌体OD600值为0.902,最高,所以选择牛肉膏作为绿豆汁培养基的氮源。与某些文献中菌株所利用的氮源不相同,是由于菌株的种类不同能够利用的氮源也不相同[21]。

图4 不同氮源对菌体浓度的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on cell concentration

2.3.4 氮源添加量对菌体生长的影响 由图5可知,牛肉膏添加量为2.0%时,菌体OD600值最高为0.956,所以牛肉膏的添加量确定为2.0%。与其它文献中提到的菌种相比[21],最佳氮源的种类和添加量都不同,由于牛肉膏是从天然材料中提取出来的，与其他无机氮源相比，其中所含营养物质并非纯化物，比例会有一定差别。

图5 氮源添加量对菌体浓度的影响Fig.5 Effect of nitrogen source addition on cell concentration

2.3.5 不同初始pH对菌体生长的影响 由图6可知,培养时间为48 h、培养基的初始pH为5.0获得的菌体OD600值最高，为0.684。与其他菌种的最佳初始pH相比[22],醋酸杆菌LLY11最佳初始pH偏低,可能是因为该菌株是从pH较低的绿豆酸浆中分离出来,对酸有一定的耐受力。

图6 不同初始pH对菌体生长的影响Fig.6 Effect of different initial pH values on cell growth

2.3.6 不同培养温度对菌体生长的影响 由图7可知,在30 ℃下，分别培养24、48、72 h,菌体OD600值最高,分别为0.385、0.507、0.529,说明LLY11菌株最适生长温度为30 ℃。相较于其它细菌[23],LLY11菌株的最适培养温度偏低,但是也属于正常范围内。

图7 不同培养温度对菌体生长的影响Fig.7 Effect of different culture temperature on cell growth

2.3.7 菌体生长曲线的测定 由图8可知,在接入绿豆汁培养基后,菌体生长进入延滞期。12～24 h菌体处于对数生长期,菌体的活菌数大体上呈上升趋势。24～39 h菌体的活菌数开始下降,可能是由于培养基中的某种营养成分缺乏,但从39～42 h菌体的活菌数又明显的上升,并达到最大值,为4.77×109。菌体的生长曲线出现双峰,出现这种现象的可能原因为细胞在利用多种糖类组成的混合碳源时要按照一定的顺序依次利用。大部分的细菌可以从不同碳源的混合物中选择性消耗某些碳源并发生二次生长,这种现象被称为分解代谢阻遏[24]。42 h后,由于菌体的大量繁殖,培养基中的营养物质被大量消耗,有害代谢物不断积累,菌体的活菌数急速的下降,进入衰亡期。LLY11生长曲线的稳定期较短，可能是测定时间间隔较长造成。

图8 Acetobacter indonesiensis LLY11生长曲线Fig.8 Growth curve of the Acetobacter indonesiensis LLY11

3 结论

从自然发酵的绿豆酸浆中筛选分离出5株对淀粉有絮凝活性的菌株,鉴定其中絮凝活性最高菌株LLY11为Acetobacterindonesiensis,命名为AcetobacterindonesiensisLLY11。采用单因素实验对AcetobacterindonesiensisLLY11培养条件进行优化,确定菌体的适宜培养条件:分别以葡萄糖1%、牛肉膏2%作为绿豆汁培养基的碳源和氮源、培养基初始pH5.0、培养温度30 ℃。在此条件下测定菌体生长曲线,0～12 h,菌体处于延滞期;从12 h开始进入对数期,活菌数量快速增长,分别在24 h和42 h菌体数量达到最高值。在30～40 h菌体的生长进入稳定期,42 h后开始进入衰亡期。

[1]张明. 副干酪乳杆菌絮凝活性的优化及絮凝活性物质的研究[D].锦州:锦州医科大学,2016.

[2]张明,顾英,张莉力,等. 响应面法优化絮凝甘薯淀粉的副干酪乳杆菌L1的增值培养基及培养条件[J].饲料研究,2015(9):64-68.

[3]王晓晕. 酸浆中乳酸菌的分离鉴定及其在大米淀粉提取中的应用[D].成都:四川农业大学,2010.

[4]李文浩,沈群. 酸浆法沉降淀粉机理研究现状[J].食品工业科技,2010(5):382-383.

[5]Zhang L,Yu Y,Li X,et al. Starch flocculation by the sweet potato sour liquid is mediated by the adhesion of lactic acid bacteria to starch[J]. Frontiers in Microbiology,2017(8):1412.

[6]韩梅,张莉力. 绿豆酸浆中高淀粉结合性菌种絮凝特性的研究[J].饲料研究,2016(13):41-44.

[7]张莉力,许云贺,李新华,等. 副干酪乳杆菌副干酪亚种L1的培养条件及絮凝活性研究[J]. 食品工业科技,2011(3):139-141.

[8]刘文菊,沈群,刘杰,等. 两种绿豆淀粉理化特性比较[J]. 食品科技,2005(9):39-42.

[9]张莉力,许云贺,李新华,等. 甘薯酸浆中微生物絮凝性研究[J].食品工业科技,2010,31(6):172-175.

[10]张莉力,许云贺,李新华,等. 自然发酵甘薯酸浆中乳酸菌的筛选与鉴定[J].安徽农业科学,2009,37(l):9-10.

[11]刘杰. 酸浆法生产绿豆淀粉工艺及性质的研究[D].北京:中国农业大学,2005.

[12]李新华,赵晓阳,张荔力,等. 副干酪乳杆菌对甘薯浆液中淀粉絮凝机理研究[J].食品科学,2010,31(19):273-276.

[13]马立周,李江华,房峻,等. 1株产丝氨酸羟甲基转移酶菌株的分离鉴定及其培养条件优化[J].食品与发酵工业,2008,34(5):18-23.

[14]张丽娜,荣昌鹤,何远,等. 常用系统发育树构建算法和软件鸟瞰[J].动物学研究,2013,34(6):640-650.

[15]董安国,高琳,赵建邦,等. 基于 DNA 序列的系统进化树构建[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2008,36(10):221-226.

[16]姜自锋,窦向梅,黄大卫,等. 系统发育研究中多重序列比对常见问题分析[J]. 动物分类学报2006,31(1):81-87.

[17]王薇. 产絮菌合成生物絮凝剂特性及絮凝成分解析[D]. 哈尔滨:哈尔滨工业大学,2009,6:31-46.

[18]Deutscher J,Francke C,Postma P W,et al. How phosphotransferase system-related protein phosphorylation regulates carbohydrate metabolism in bacteria[J]. Microbiol Mol

Biol R,2006,70(4):939-1031.

[19]高忠江,施树良,李钰,等. SPSS方差分析在生物统计的应用[J].现代生物医学进展,2008,8(11):2116-2120.

[20]李小胜,陈珍珍. 如何正确应用SPSS软件做主成分分析[J].统计研究,2010,27(8):105-108.

[21]刘娣,秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆[D].北京:中国农业科学院,2008.

[22]马悦培,高红亮,常忠义,等. 不同初始pH对丙酸杆菌细菌素发酵的影响[J].食品工业科技,2010(5):215-217.

[23]韩梅,北京豆汁优势菌群分析及豆汁发酵饮料的研制[D].锦州:锦州医科大学,2017.

[24]熊得王,刘晴,姚瑞莲,等. crp 基因突变对大肠杆菌利用混合碳源的影响[J].高校化学工程学报,2015,29(6):1390-1398.