lQGAP1诱导肝细胞肝癌干性促进血管生成拟态形成的实验研究*

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中国较为常见的恶性肿瘤之一，严重危害人民的健康［1］。目前，针对HCC的治疗手段主要是手术切除和肝移植。肝癌肝移植的总体疗效优于手术切除，但是肝移植的发展局限于现阶段移植器官的不足［2-3］。由于HCC的高侵袭性和高转移性，患者的复发率较高，预后较差，死亡率较高。因此，寻找有效的方法评估患者的预后和生存情况至关重要。近年来的研究表明，HCC的发生、发展和转移机制相当复杂，其中肿瘤血管生成和血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）起着重要作用。VM是一种管壁由肿瘤细胞围成，不依赖机体内皮细胞的肿瘤微循环模式。肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道，而血液则在这无内皮细胞的管道中流动。具有VM的肿瘤恶性度较高，生长迅速且转移率高［4-5］。

具有IQ结构域的GTP激酶活化蛋白1（IQ-motif containing GTPase activating protein 1，IQGAP1），是新近发现的一种Ras GTP酶活化蛋白质，是Rho家族成员Racl和cdc42的一个重要效应因子［6-7］。IQGAPl能够参与多种细胞的分子生物学功能，包括细胞骨架重塑、细胞黏附、细胞增殖、细胞分化等［8-10］。IQGAP1在许多肿瘤中高表达，并对肿瘤细胞的侵袭、增殖和血管生成等方面存在明显的促进作用［11-12］。

目前，IQGAP1与VM的形成以及其促进HCC发生发展的机制尚不明确，本研究旨在通过调控IQGAP1在HCC中的表达，研究其促进VM发生发展的机制，并为HCC的治疗提供新思路和新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 收集2001年1月至2009年1月天津医科大学肿瘤医院存档的HCC手术切除标本180例，病理诊断为原发性HCC，并且随访资料完整。全部病例均为手术标本且患者术前未行放化疗，组织标本及病例资料的使用均经天津医科大学伦理委员会审查批准。

1.1.2 细胞株 人肝癌细胞株Bel7402、SMMC7721、MHCC97L和HepG2细胞系（均购自美国ATCC公司）。

1.1.3 主要试剂 MEM、RPMI-1640培养基和Opti-MEM培养基（购自美国Neuronbc公司），胎牛血清（购自美国Gibco公司）。质粒及慢病毒包装试剂盒（购自美国Genecopoeia公司）：IQGAP1过表达质粒（EX-E0228-Lv201），IQGAP1过表达对照质粒（EX-NEG-Lv201），IQGAP1降表达质粒（HSH021588-LVRU6MP），IQGAP1降表达对照质粒（CSHCTR001-LVRU6MP），慢病毒包装试剂盒（203WUO501）。Matrigel胶（购自美国Invitrogen公司）。IQGAP1抗体（购自美国Abcam公司，ab133490），CD133（购自美国Biorbyt公司，orb9913），CD44（购自美国Abcam公司，ab119863），Sox2（购自美国GeneTex公司，GTX101507），ALDH1（购自美国Abcam公司，ab23375），GAPDH（购自美国Santa Cruz公司，Sc25778）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色 免疫组织化学染色采用PV6000试剂盒。所有标本均为石蜡包埋组织，5 mm厚切片，经脱蜡水化，3%H2O2封闭内源性过氧化酶，微波热修复，血清封闭，一抗4℃孵育过夜。次日滴加二抗孵育1 h，DAB显色，苏木素复染核，封片。

1.2.2 CD31与PAS双重染色 常规染完CD31后，将组织切片置于过碘酸钠中10 min，蒸馏水洗2次，然后滴加雪夫试剂15 min，置于37℃孵箱避光反应15 min，自来水冲洗20 min，蒸馏水洗2次，苏木素复染核、封片。

1.2.3 细胞培养 人肝癌细胞系HepG2，SMMC7721培养于37℃，5%CO2恒温恒湿培养箱。HepG2培养基为MEM+10%胎牛血清（FBS）+1%双抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）+1%非必需氨基酸+1%丙酮酸钠；SMMC7721培养基为RPMI-1640+10%FBS+1%双抗。

1.2.4 细胞转染 在6孔板中培养细胞，转染前1天换灭活血清培养，培养至合适浓度后，每孔添加1 mL病毒液+1 mL培养基+10 mL Polybrene，12 h换成含血清的完全培养基常规培养，荧光观察转染效率，嘌呤霉素药筛。

1.2.5 Western blot法 将提取的蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，PVDF膜转膜90 min。在5%脱脂奶粉中室温封闭 1 h，添加抗体 IQGAP1（1：5 000），CD133（1：500），CD44（1：500），Sox2（1：500），ALDH1（1：200），GAPDH（1：1 000），4℃孵育过夜，次日恢复室温后与二抗室温孵育2 h，TBST漂洗PVDF膜，加入发光液，显影，照相。蛋白条带的灰度定量分析采用Image J软件处理。

1.2.6 细胞迁移侵袭实验 侵袭实验前1天在Transwell小室中加入30 mL Matrigel胶，迁移不铺胶，放置于24孔板中，于培养箱中过夜。采用无血清培养基制备细胞悬液，调整细胞密度至1×105个/mL，于小室上层加入200 mL细胞悬液，下层加入500 mL含血清的完全培养基，迁移实验培养24 h后取出Transwell小室，侵袭实验48 h后取出，用冷甲醇固定，0.4%结晶紫染色，于倒置显微镜下观察并统计数据。

1.2.7 平板克隆形成实验 细胞重悬调整细胞浓度至103个/mL，六孔板内每孔吸取50 mL细胞悬液，补加培养液至2 mL，摇匀，常规培养2～3周，当出现肉眼可见克隆时终止培养，显微镜观察照相。甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min，自来水冲洗晾干照相。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。应用χ2检验分析IQGAP1蛋白和临床病理特点的关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，分析IQGAP1对HCC预后的价值。计量资料采用t检验分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 IQGAP1的表达及其与VM、肝癌患者临床病理资料的关系

免疫组织化学染色后IQGAP1阳性呈棕黄色，定位于细胞膜、细胞质（图1）。CD31/PAS双染结果显示，内皮依赖性血管是由CD31阳性的血管内皮细胞围成，管腔内可见红细胞；VM则由肿瘤细胞围成的管腔样结构，PAS阳性物质衬覆，管腔内存在红细胞（图2）。

在180例HCC病例中，IQGAP1阳性率为59.4%（107/180）。统计学分析显示IQGAP1的表达与年龄、性别、肿瘤直径无关，而与肿瘤分级、转移、VM相关（表1）。在107例IQGAP1阳性的病例中，VM的阳性率为35.5%（38/107）；在73例IQGAP1阴性的病例中，VM的阳性率为13.7%（10/73）。生存分析显示，IQGAP1阳性患者较IQGAP1阴性患者的生存时间短，差异具有统计学意义（χ2=7.889，P=0.005，图3）。

图1 IQGAP1在HCC中的表达定位于细胞膜、细胞质（IHC×200）

图2 不同IQGAP1表达水平的HCC组织中VM与血管生成情况（IHC×400）

2.2 IQGAP1对细胞生物学行为的影响

比较Bel7402、SMMC7721、MHCC97L和HepG2 4种细胞系中IQGAP1的表达。结果显示，HepG2细胞IQGAP1蛋白表达水平最低，而SMMC7721细胞IQGAP1蛋白表达水平最高（图4）。将IQGAP1上调质粒及上调对照质粒转入HepG2细胞，将IQGAP1下调质粒及下调对照质粒转入SMMC7721细胞。细胞转染以后，以HepG2 IQGAP1、SMMC7721 shIQGAP1为实验组，各自对照组为HepG2对照组和SMMC7721对照组。各实验组与对照组进行比较，得出下述结果。迁移侵袭实验结果显示：在迁移实验中，HepG2细胞上调IQGAP1后，与对照组相比，穿过小室的细胞数增多，SMMC7721细胞下调IQGAP1后，与对照组相比，穿过小室的细胞数减少。在侵袭实验中，HepG2对照组细胞仅能穿过5个细胞，上调IQGAP1后，穿过的细胞个数是对照组的4倍，SMMC7721实验组与对照组相比，穿过的细胞数明显减少。两部分的实验结果表明，IQGAP1可以增强HCC细胞的迁移侵袭能力，差异具有统计学意义（P＜0.05，图5）。

表1 lQGAP1的表达与肝细胞肝癌临床病理特征的关系

图3 IQGAP1阳性患者与IQGAP1阴性患者的生存期比较

平板克隆形成实验结果显示，HepG2对照组与HepG2 IQGAP1细胞均能形成克隆，而HepG2 IQGAP1组的克隆数量明显多于HepG2对照组，HepG2 IQGAP1组的克隆大小是HepG2对照组克隆大小的两倍。SMMC7721对照组与SMMC7721 shIQGAP1组相比，shIQGAP1组的克隆数量比对照组明显减少，shIQGAP1组的克隆大小明显＜对照组。结果表明，IQGAP1可以增强HCC细胞增殖能力，差异具有统计学意义（P＜0.05，图6）。

图5 过表达IQGAP1对HepG2细胞侵袭能力的影响和降表达IQGAP1对SMMC7721细胞侵袭能力的影响

三维培养结果显示：HepG2细胞不具有形成三维管道的能力，而IQGAP1上调以后，出现了明显的管道样结构。SMMC7721本身能够形成三维管道，而下调其IQGAP1的表达以后，三维管道形成能力明显削弱。结果表明，IQGAP1可以增强HCC细胞三维成管的能力，差异具有统计学意义（P＜0.05，图7）。

2.3 IQGAP1的升高增强了HCC干性相关蛋白的表达

使用Western blot法检测转染后HepG2、SMMC7721细胞中CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表达情况。结果显示，在HepG2细胞上调IQGAP1以后，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表达明显升高，在SMMC7721细胞中下调IQGAP1以后，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表达明显降低（P＜0.05，图8）。

图6 IQGAP1对HCC的增殖能力的影响

图7 IQGAP1对HCC细胞管道形成能力的影响

图8 Western blot法检测相关蛋白的表达变化

细胞免疫荧光显示,在HepG2细胞中，上调IQGAP1的表达，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表达增高，而在SMMC7721细胞中，下调IQGAP1的表达，CD133、CD44、Sox2和ALDH1的表达降低。结果表明，随着IQGAP1的升高，HCC细胞的干性相关蛋白表达也增强（图9）。

图9 细胞免疫荧光检测干性相关蛋白的变化（Immunofluorescence×200）

3 讨论

肿瘤的发生是一个长期、多阶段、多重基因突变的复杂过程［13］。癌细胞的无限增殖和转移是较为重要的肿瘤恶性生物学行为，肿瘤的生长需要营养的供给，血管形成是肿瘤转移的基础［14］。多数癌症患者死于肿瘤的复发和转移，导致死亡的原因主要是肿瘤转移直接侵犯器官、副肿瘤综合征和（或）治疗引起的并发症，因此明确肿瘤的复发尤其是转移机制，可以为肿瘤的预防和治疗提供一些新的思考方向和治疗策略。

IQGAP1是一种分子量为189 kD的细胞骨架蛋白，主要在肿瘤细胞的运动和增殖等方面发挥重要作用。本研究结果表明，IQGAP1在HCC组织中呈高表达，且与肿瘤的分级、转移和VM的形成相关。将过表达质粒转入HepG2细胞后，迁移侵袭增殖能力明显增强，而将干扰质粒转入SMMC7721后，迁移侵袭增殖能力明显减弱。IQGAP1可以通过多种途径影响迁移侵袭，如激活Rac1/Cdc42信号通路，促使细胞形成侵袭性伪足，与肌动蛋白形成多聚体，引导细胞定向运动，促进肿瘤转移［15］。IQGAP1的增高还可以减少正常细胞连接的E-cadherin复合体形成，降低细胞间的黏附力，加速肿瘤细胞的脱落、转移［16］。同时，IQGAP1的过表达还可以加速细胞外基质的降解，从而增强肿瘤细胞的侵袭能力［17］。IQGAP1具有促进细胞增殖的能力，在MAPK/Raf/MEK/ERK信号传导通路、Wnt通路中均发挥重要作用［18］。

CD133、CD44是已经明确的HCC标志物［19］。CD133是一种跨膜糖蛋白、经典的肿瘤干细胞标记物，CD133参与肿瘤的生成，提高化学耐药性及出现原始异型性肿瘤的能力。CD44是一种细胞表面黏附分子，广泛分布于细胞膜表面，与透明质酸反应后能促进毛细血管增生，促进肿瘤的发展与转移。Sox家族最初发现于胚胎干细胞，是维持胚胎干细胞生长，控制胚胎发育的重要转录因子。相关研究表明，Sox2的增多与HCC细胞密切关联［20］。ALDH1属于乙醛脱氢酶的基因家族编码的蛋白质之一，具有乙醛脱氢酶的生物学特性，可在医学中作为肿瘤干细胞标志物。大量研究表明，ALDH1在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［21］。

IQGAP1是IQGAP蛋白家族中研究较为深入且功能广泛的成员。本研究表明，IQGAP1在HCC组织中高表达，与患者的临床分期、转移、不良预后及VM的形成相关。细胞实验显示，随着IQGAP1表达的增高，细胞的迁移、侵袭、增殖、成管能力也增强，CD133、CD44、Sox2和ALDH1表达同时增加。本研究从人体组织和体外细胞两方面探讨了IQGAP1在HCC的VM形成中的作用，证明了IQGAP1与VM的形成密切相关，IQGAP1的升高促进了HCC细胞的恶性生物学行为，增强了HCC细胞的干性，推测IQGAP1可能是通过诱导HCC细胞的干性来促进VM的形成。本研究丰富了IQGAP1在HCC发生发展过程中的作用，为HCC VM的发展机制提供了新的视角。随着IQGAP1的研究深入，亟需出现以IQGAP1为靶向的抗肿瘤药物应用于HCC及其他肿瘤的预防。

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