NOD1/2及其在奶牛乳腺炎中作用研究进展

刘 畅，曹钰晗,赵春阳，徐璐尧，张文劲，赖金伦，陈颖钰,2，郭爱珍,2，胡长敏,2*

(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070；2.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070)

乳腺炎是养牛业最常见重要疾病之一，其临床特征表现为乳房炎症及产奶量和牛乳质量的下降，主要流行病学特征为发病率高、发病范围广、病因复杂及防治困难[1]。奶牛乳腺炎的发生发展与病原微生物、环境、管理等因素密切相关，同时与奶牛自身的天然免疫机能密切相关。

天然免疫又称先天性免疫或固有免疫，是防止病原微生物进入宿主体内的第一道防线，与获得性免疫共同构成机体的免疫系统。天然免疫中的重要组成部分——模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)的研究成为热点。模式识别受体存在于多种动植物细胞中，且能够通过识别病原微生物的保守序列——病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)来判断和识别不同于机体自身的“非我”病原微生物，进而启动相关反应。模式识别受体主要包括Toll样受体家族(Toll-like receptors,TLRs)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白受体家族(nucleotide binding oligomerization domain(NOD)-like receptors,NLRs)、维甲酸诱导基因Ⅰ型受体家族 (retinoic acid-induced gene-Ⅰ like helicases,RLHs)及HIN-200蛋白家族。本文对核苷酸结合寡聚化结构域蛋白(nucleotide binding oligonucleotide dimerization domain,NOD)家族中NOD1、NOD2在奶牛乳腺炎中的最新研究情况进行综述。

1 NOD样蛋白受体家族

NOD样蛋白受体家族是一类存在于胞浆内含有核苷酸结合寡聚化结构域的可溶性蛋白家族，且遗传高度保守。NOD样受体家族与多种疾病和自发炎症失调密切相关，如克罗恩病、布劳综合征、哮喘、周期热、穆韦二氏综合征、癌症及心血管疾病等。

哺乳动物中NOD样受体家族成员有20余个，根据NOD样受体家族分子效应区的不同可将NOD样受体家族分为以下几个亚类：即NODs、NALPs(NACHT-LRR-PYD-containing proteins)、CIITA(MHC class Ⅱ transcription activator)、IPAF(ICE(IL-1β-converting enzyme)-protease-activating factor)与NAIP(neuronal apoptosis inhibitor protein)[2]。

NOD样受体家族分子包括3个特异性结构域，N端的效应结构域，不同亚类的组成不同，可为热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)，也可为半胱天冬酶活化募集结构域(caspase-activiting and recruitment domain，CARD)，两者虽结构不同但均可募集下游效应信号分子；中央是核苷酸结合寡聚化区域(nucleotide-binding and oligomerization，NACHT)(又称NOD结构域)，具有结合核酸及ATP酶活性，对NOD样受体家族的寡聚体化和活化极为重要；C端为富亮氨酸重复序列(leucine-rich-repeat,LRR)结构域，可探测和识别配体(包括保守的 PAMP或其他配体)，同时也介导自身调控和蛋白间的相互反应[3]。

NOD样受体家族信号通路起始于C端LRR结构域识别相应的PAMP，当PAMP直接或间接结合到 LRR 后，NOD样受体家族分子通过改变构象，暴露出中央的NACHT结构域，从而触发寡聚体化(可能形成六聚体或七聚体)，同时暴露出N端的效应结构域，启动下游信号通路[4]。

2 NOD1与NOD2作用研究

2.1 NOD1与NOD2 异同

NOD1(又名CARD4)与NOD2(又名CARD15)是NOD样受体家族中最早发现的细胞内模式识别受体，分别识别细菌的细胞壁成分肽聚糖(peptidoglycan，PGN)中特定的分子[5]。两者在结构与作用上相似却略有不同，本文在此进行简单总结。

NOD1与NOD2的N端均为CARD区域，但NOD1只有1个 CARD 结构域而 NOD2有2个；位于中央的NACHT区域，该区域包含P环(P-loop,或称Walk A Box)和Mg2+结合位点(Walker B Box)，可介导NOD1和NOD2分子自身发生寡聚反应[6]。此外，NOD1和NOD2功能上有所区别，NOD1和NOD2均可识别细菌细胞壁的肽聚糖结构，但NOD1能够识别的最小配体是肽聚糖中的γ-谷氨酰基-D-内消旋-二氨基庚二酸(γ-D-glutamyl-meso-diaminopimelic acid，iE-DAP)，NOD2识别肽聚糖中结构高度保守的胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MDP)。

NOD1/2有着相似的结构和功能，但是可能也因为结构上细微的差异决定其功能、配体的不同。

2.2 NOD1在天然免疫反应中作用机制研究

NOD1除可被细菌激活外，还可被其他微生物激活。研究证明 ，NOD1能够广泛表达于呼吸系统的呼吸道上皮细胞及肺部组织，且肺部感染烟曲霉菌时NOD1的表达水平显著上调，表明NOD1在真菌感染时发挥一定的作用[7]。丙型肝炎病毒(HCV)的RNA依赖性RNA聚合酶NS5B具有复制活性，NS5B刺激原代和传代肝细胞可激活NOD1通路，表明肝细胞的NOD1可识别病毒复制过程中产生的双链RNA，并且介导天然免疫的产生[8]。也有研究表明巨噬细胞中NOD1/RIP2信号通路能被氧化型低密度脂蛋白激活并且呈现剂量依赖性，NOD1/RIP2信号通路激活后促使巨噬细胞的炎性活化及其表型变化，这可能是其参与动脉粥样硬化形成和发展过程的主要机制[9]。这些结果均提示NOD1可调控宿主天然免疫进程进而在多种疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。

2.3 NOD2在天然免疫反应中的作用机制研究

NOD2能识别细菌细胞壁肽聚糖的裂解产物MDP，并广泛参与细胞内病原微生物的识别及炎症应答，但有研究表明NOD2也可识别病毒组分。Sabbah A等[10]研究发现，NOD2能对单链RNA产生免疫应答并能激活IRF3产生IFN-β，感染呼吸道合胞体病毒、胞疫性口炎或者流感病毒(均为含有单链RNA基因组的病毒)均能观察到NOD2介导的IRF3激活；研究发现NOD2可以识别疱疹病毒科中的人类巨噬细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)，该种病毒同时含有DNA和RNA，HCMV感染U373胶质瘤细胞后NOD2表达量显著升高，下游炎性因子如IFN-β、IL-8等表达升高，同时病毒复制受抑制，但用疱疹病毒1和疱疹病毒2进行相同试验却不能激活NOD2[11]。NOD2与黏膜免疫密切相关，大量研究表明人肠道疾病克罗恩病的发生与发展和NOD2的突变密切相关，Ramanan D等[12]研究发现NOD2可通过限制普通拟杆菌的扩散防止小肠炎症发生。

综上所述NOD2可被多种病原微生物激活，包含细菌和病毒等，同时NOD2参与肠道黏膜免疫，表明NOD2对于机体抵抗病原微生物感染以及触发机体免疫反应均发挥重要作用。

3 NOD1/2信号通路

TLRs和NLRs是目前被广泛研究的模式识别受体，TLRs主要存在于细胞膜，而NLRs主要存在于细胞质中，识别躲避位于细胞膜的TLRs而进入胞内的PAMPs，但是目前对于这些PAMP是如何躲避了TLRs的监视进入细胞质的机制还未明确，可能与胞吞作用有关。

3.1 NOD1/2经典信号通路

NOD1/2 通过LRR区域识别进入细胞的PAMP，随后自身寡聚化形成同源二聚体，并通过 CARD 结构域招募同样具有CARD结构域的接头分子受体互作蛋白RIP2(receptors interaction protein 2)，RIP2 是一种丝氨酸苏氨酸激酶，使用RIP2抑制剂可以阻断MDP对NOD2的激活作用。RIP2活化后直接接触支架蛋白亚基 IKKγ(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase γ )，IKKγ是IKK(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)复合物的调节亚基，通过激活IKKγ的辅酶和 IκB (inhibitor of nuclear factor kappa-B)激酶 IKKα 和 IKKβ，从而形成活化的IKK复合物，进而激活NF-κB信号通路[13]。此外，RIP2还能够通过K63介导的泛素化过程招募并激活转化生长因子β激活激酶1(TGFβ-activated kinase 1,TAK1)，TAK1后续激活MAPKs和IKK复合物，激活MAPKs和NF-κB信号通路[14]。

3.2 新发现的NOD1/2信号通路

随着研究的深入，不少学者发现细胞内部存在一些新的蛋白可参与或调控NOD1/2通路。Travassos L H等[15]发现NODs可将ATG16L1募集至细菌进入位点后互作，并以RIP2非依赖的方式促进自吞噬作用的发生。

同时，有研究发现在细胞中存在一些细胞因子可参与NOD1/2信号通路的调节。Lecat A等[16]研究发现一种新的负调控蛋白JNKBP1，其可抑制MDP对NOD2信号通路的激活，且NOD2下游信号NF-κB的活化、IL-8的分泌、NOD2杀菌作用等亦受限。Park S等[17]研究发现，细胞中存在p62/SQSTM1蛋白通过稳定NOD2寡聚化增强NOD2信号通路的活化及炎症因子的表达。

由此可见，NOD下游作用分子不仅限于RIP2，还有多种下游分子参与或调控NOD信号通路的反应进程。

4 NOD1/2与奶牛乳腺炎

奶牛乳腺炎是病原微生物侵入乳房后导致乳房红肿、发炎、产奶量减少，甚至导致奶牛淘汰的一种奶牛高发病，给养牛业造成巨大的损失。同时，也给人类健康带来巨大威胁。引发乳腺炎的主要病原微生物包括金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、无乳链球菌及大肠埃希菌等。

徐丹丹等利用金黄色葡萄球菌构建小鼠乳腺模型，随NOD1、NOD2 mRNA表达升高，RIP2、NF-KB、IL-6及TNF-α的mRNA表达水平也升高，表明NOD1、NOD2可能参与金黄色葡萄球菌的识别及下游通路的激活，从而参与乳腺免疫应答[18]。金黄色葡萄球菌刺激奶牛乳腺上皮细胞可促进NOD2水平升高，而灭活的金黄色葡萄球菌未有促进作用[19]，表明金黄色葡萄球菌既可作用于小鼠也可作用于奶牛乳腺细胞，并依赖于NOD1/2。

近年来，国内外综合防治乳腺炎措施以菌苗预防为主，葡萄球菌和链球菌引起的奶牛乳腺炎的发生率明显下降，大肠埃希菌为主的肠道杆菌在奶牛乳腺炎主要病原菌中的优势地位日趋明显。Roussel P等[20]发现MG1655、B1171、D6-117.29等3株大肠埃希菌可被牛乳腺上皮细胞识别，并激活NOD2触发后续炎症反应。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大肠埃希菌细胞壁的成分之一，常作为TLR4信号通路的特异性激动剂，但有研究表明粗提LPS(cLPS)可促进于牛中性粒细胞NOD1及促炎因子的表达；使用NOD1抑制剂ML130预刺激细胞，cLPS刺激细胞后促炎因子、黏附相关因子的表达量均下降，且中性粒细胞的转移能力下降[21]。这些结果均表明大肠埃希菌性乳腺炎依赖于NOD1/2通路，但具体菌体中哪种蛋白或分泌产物激活通路仍需后续深入研究。

徐绮嫔等[22]发现MDP刺激牛乳腺成纤维细胞后，NOD2、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表达均上调。李文文等[23]研究发现NOD受体表达下调或缺失是导致围产期奶牛外周PMN细胞吞噬和呼吸爆发功能减弱的重要原因，并与乳腺炎的易感性有关。刘洋等[24]用MDP刺激小鼠乳腺后TNF -α mRNA 显著升高，而 IL-6mRNA 没有显著升高，这可能与不同细胞对于MDP的应答效应不同有关。

综上所述，病原微生物及其产物刺激乳腺后分别激活乳腺的不同细胞中NOD1/2信号通路，促进获得性免疫及炎症的发生发展，但具体病原微生物中的哪些组分激活NOD1/2通路以及激活的机理尚不清楚。

5 展望

本文对NOD1/2蛋白结构、信号通路、NOD1/2与奶牛乳腺炎的关系等方面的最新研究进展进行了阶段性总结。目前对于NOD样受体家族受体的研究涵盖方向较为全面，但其在不同疾病中是如何发挥作用、发挥怎样的作用等问题仍有待研究。NOD样受体家族作为重要的质溶性模式识别受体，对于逃避了位于细胞膜上的模式识别受体而进入到细胞内部的病原微生物及其产物发挥了抑制和/或清除作用。NOD1、NOD2被相应的病原微生物或其代谢产物激活后活化下游转录因子，转录因子入核后启动相关促炎因子(IL-6、TNF-α)趋化因子(CCL2等)以及多种效应分子促进免疫应答和炎症的发生发展[25]。研发NOD样受体家族受体激活剂或者阻断剂可作为新型药物的免疫佐剂或者免疫调节剂，参与新型免疫药物对于某些炎性疾病、癌症以及病毒性疾病的治疗，但具体用法及用量仍需后期继续研究。

奶牛乳腺炎是多种不良因素共同作用于乳腺导致的炎性疾病，除物理、化学、饲养管理等致病因素外，病原微生物种类复杂是引发该病的重要因素。目前研究表明，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌刺激乳腺后触发炎症反应均依赖于NOD1/2信号通路，但其他重要致病菌，如无乳链球菌、停乳链球菌、绿脓杆菌侵袭乳腺诱发炎症是否依赖于NOD信号通路却鲜有报道，为今后的研究提供了方向。

参考文献:

[1] 杨丽华,邱建东,武守艳,等.奶牛乳腺炎的病因分析[J].中国畜牧兽医文摘,2015(12):159-160.

[2] 周宏宇,张须龙.甲型流感病毒感染后NLRP3炎症小体的活化及调控机制[J/OL].微生物学免疫学进展,2017,45(2):67-73.

[3] 王东杰,张 森,陈晓光.NOD1和NOD2受体在肿瘤发生发展中的作用[J/OL].中国生化药物杂志,2017,37(7):440-443，446.

[4] Ghosh S,Dass J F P.Study of pathway cross-talk interactions with NF-κB leading to its activation via ubiquitination or phosphorylation:a brief review[J].Gene,2016,584(1):97-109.

[6] Maekawa S,Ohto U,Shibata T,et al.Crystal structure of NOD2 and its implications in human disease[J].Nat Commun,2016,7.11813.doi: 10.1038/ncomms11813.

[7] 石 青,李 祥,罗闳丹,等.烟曲霉菌感染小鼠肺组织中NOD1信号通路的激活[J].免疫学杂志,2010(5):419-422.

[8] Vegna S,Gregoire D,Moreau M,et al.NOD1 participates in the innate immune response triggered by hepatitis C virus polymerase[J].J Virol,2016,90(13):6022-6035.

[9] 侯 亮,路英进,陈 伟,等.NOD1/RIP2 信号通路对巨噬细胞炎性活化的作用[J].中国动脉硬化杂志,2016,24(5):474-478.

[10] Sabbah A,Chang T H,Hamack R,et al.Activation of innate immune antiviral responses by Nod2[J].Nat Immunol 2009,10:1073-80.

[11] Caruso R,Warner N,Inohara N,et al.NOD1 and NOD2:signaling,host defense,and inflammatory disease[J].Immunity,2014,41(6):898-908.

[12] Ramanan D,San Tang M,Bowcutt R,et al.Bacterial sensor Nod2 prevents inflammation of the small intestine by restricting the expansion of the commensalBacteroidesvulgatus[J].Immunity,2014,41(2):311-324.

[13] Fekete T,Koncz G,Szabo B,et al.Interferon gamma boosts the nucleotide oligomerization domain 2-mediated signaling pathway in human dendritic cells in an X-linked inhibitor of apoptosis protein and mammalian target of rapamycin-dependent manner[J].Cell Mol Immunol,2017,14(4):380.

[14] Tigno-Aranjuez J T,Asara J M,Abbott D W.Inhibition of RIP2's tyrosine kinase activity limits NOD2-driven cytokine responses[J].Gene Dev,2010,24(23):2666-2677.

[15] Travassos L H,Carneiro L A M,Ramjeet M,et al.Nod1 and Nod2 direct autophagy by recruiting ATG16L1 to the plasma membrane at the site of bacterial entry[J].Nat Immun,2010,11(1):55-62.

[16] Lecat A,Di Valentin E,Somja J,et al.The c-Jun N-terminal kinase (JNK)-binding protein (JNKBP1) acts as a negative regulator of NOD2 protein signaling by inhibiting its oligomerization process[J].J Biol Chem,2012,287(35):29213-29226.

[17] Park S,Ha S D,Coleman M,et al.p62/SQSTM1 enhances NOD2-mediated signaling and cytokine production through stabilizing NOD2 oligomerization[J].PLoS One,2013,8(2):e57138.

[18] 徐丹丹,杨 彬,孙志鹏,等.NOD1/NOD2 介导的信号通路在小鼠金黄色葡萄球菌性乳腺炎中的作用[J].中国预防兽医学报,2015,37(7):528-531.

[19] 杨 彬,吕红发,孙东波,等.金黄色葡萄球菌促进奶牛乳腺上皮细胞NOD2的表达[J].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(6):741-745.

[20] Roussel P,Porcherie A,Répérant-Ferter M,et al.Escherichiacolimastitis strains:Invitrophenotypes and severity of infectioninvivo[J].PLoS One,2017,12(7):e0178285.

[21] Wei L J,Tan X,Fan G J,et al.Role of the NOD1/NF-κB pathway on bovine neutrophil responses to crude lipopolysaccharide[J].Vet J,2016,214:24-31.

[22] 徐绮嫔,王 寒,廖纯颖,等.病原体相关分子模式(PAMP)诱导对奶牛乳腺成纤维细胞TLR4,NOD2,IL-6,IL-8和TNF-αmRNA表达的影响[J].中国兽医学报,2015,35(12):1943-1947.

[23] 李文文,卢 政,谭 勋,等.围产期奶牛Nod-2受体表达变化及其对中性粒细胞呼吸爆发功能的影响[J].中国农业科学,2011,45(3):556-561.

[24] 刘 洋,高国强,谭 浩,等.胞壁酰二肽对小鼠乳腺组织和乳腺细胞 NOD2 表达的影响[J].黑龙江畜牧兽医,2016 (2):19-21.

[25] Tada H,Aiba S,Shibata K I,et al.Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with Toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells[J].Infect Immun,2005,73(12):7967-7976.