斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因的克隆及原核表达

王文龙，冯陈晨，王金玲，呼和巴特尔，刘春霞

(1.内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010018)

斯氏副柔线虫病是由斯氏副柔线虫(Parabronemaskrjabini)寄生于骆驼、牛、羊等反刍动物真胃引起的一种寄生虫病,尤以骆驼感染较为严重[1-3]。大量虫体寄生可导致患畜真胃发生炎症、出血及溃疡,严重者造成骆驼死亡,对养驼业危害极大，是危害我国养驼业的一种主要寄生虫病，给农牧民带来了巨大的经济损失。因此，对斯氏副柔线虫病的监测和诊断是骆驼寄生虫病防控中的重点。

由于骆驼多分布在第三世界国家的落后地区，所以时至今日，国内外关于斯氏副柔线虫病的研究相对滞后，主要是关于分类和传播媒介的研究[4-6]。在骆驼斯氏副柔线虫病的防控上，目前存在的主要问题是缺少针对该病的系统的基础理论研究、缺乏有效的生前诊断方法和防治的新方法。适用于许多寄生性线虫的粪便虫卵检查法可用于该病的诊断，但检出率非常低，很难用于临床实践。该病的诊断主要依靠死后剖检(在真胃查找虫体)，此类诊断方法不能为早期治疗提供参考。在实际生产中，往往是在没有诊断依据的情况下盲目地给药驱虫，造成经济损失的同时也带来了诸如毒副作用、出现耐药虫株及畜产品兽药残留超标等诸多弊端。

因此，本研究在斯氏副柔线虫转录组测序分析的基础上[7]，筛选出了半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因作为候选抗原基因，对其进行功能注释，生物信息学分析，并对该基因进行了克隆、原核表达和抗原性验证。研究结果可为该病的血清学诊断方法和免疫防控研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体、血清、质粒与菌株 斯氏副柔线虫采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特后旗骆驼体内，液氮中保存；斯氏副柔线虫病骆驼阳性血清、阴性血清均采自内蒙古巴彦淖尔市乌拉特后旗；pMD19-T simple vector，Takara公司产品；表达载体pET30a(+)，Invitrogen公司产品；大肠埃希菌DH5α、BL21(DE3)，北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.2 主要的酶和试剂 总RNA提取试剂RNAiso Plus、Primer ScriptTM RT reagent Kit、DNA A-Tailing Kit，宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒小提试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，AXYGEN公司产品；BCA Protein assay kit、Ni-NTA SefinoseTMResin Kit、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Prime STAR®GXL DNA Polymerase、DNA T4连接酶，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；化学发光(ECL)底物显影液，Thermo Scientific公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼IgG，由上海生工生物工程技术服务有限公司制备。

1.2 方法

1.2.1 Pj-CPR基因生物信息学分析 利用生物信息学软件对斯氏副柔线虫转录组测序得到的Pj-CPR基因进行生物信息学分析。用ExPASy(http://web.expasy.org/translate/)和ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/)软件预测开放阅读框，SignalIP4.1 server(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/)在线软件进行信号肽序列预测；SecretomeP.2.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/Secret omeP/)软件进行非典型蛋白分泌物预测；TMHMM server.v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services /TMHMM/)软件进行跨膜蛋白结构域分析；TargetP 1.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services /TargetP/)软件预测真核生物蛋白亚细胞定位；BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ services/BepiPred/)软件进行抗原表位预测。

1.2.2 Pj-CPR基因的扩增及克隆测序 根据斯氏副柔线虫转录组测序中半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因序列设计1对引物并分别在上游引物和下游引物中引入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点。上游引物：5′-CGGAATTCATGAAACGTTCCCTCCTC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGTTCATATGTTTCTTCACC-3′，引物由华大基因有限公司合成。

参照RNAiso Plus说明书提取斯氏副柔线虫总 RNA，利用反转录试剂盒(Primer ScriptTMRT reagent Kit)合成cDNA，再以RNA反转录产物为模板，PCR扩增目的基因。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环；最后72℃ 10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经纯化后，与pMD19-T simple vector连接，连接产物转化大肠埃希菌DH5α，PCR及EcoRⅠ/XhoⅠ质粒双酶切鉴定为阳性的菌株由华大基因公司进行双向测序。

1.2.3 原核表达载体的构建 从测序结果正确的菌株中提取克隆质粒(命名为pMD-CPR)，将pMD-CPR和表达载体pET30a(+)分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后，以凝胶回收试剂盒回收目的基因和载体片段，用T4 DNA连接酶连接构建Pj-CPR基因原核表达载体(命名为pETCPR)并转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。在含卡那霉素的固体LB培养基培养后，挑取单菌落分别进行质粒电泳、PCR和质粒双酶切鉴定，阳性菌株送华大基因公司进行序列测定。

1.2.4 重组菌的诱导表达及诱导条件的优化 重组表达菌BL21(pETCPR)用1.0 mol/L IPTG诱导表达后，经超声波裂解菌体，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE检测重组蛋白的表达形式。

采用不同诱导剂浓度、不同时间及不同温度诱导重组表达菌，SDS-PAGE电泳分析，确定最佳诱导条件。Pj-CPR基因重组表达菌诱导培养后，收集菌体，以溶菌酶和超声波法裂解菌体，离心收集包涵体沉淀，用8 mol/L尿素溶解，再离心收集上清液，以0.45 μm孔径滤器过滤后，按照上海生工Ni-NTA SefinoseTMResin Kit步骤纯化重组蛋白。

1.2.5 重组蛋白的Western blot检测 重组蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上。用含50 g/L脱脂奶粉的封闭液于室温封闭3 h；以骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清(1∶1 000)为一抗，同时设阴性血清对照；以辣根过氧化物酶标记的兔抗骆驼IgG为二抗(1∶5 000)，用ECL超敏显影液显色进行Western blot检测。

2 结果

2.1 Pj-CPR基因生物信息学分析

通过ExPASy和ORFfinder在线软件对Pj-CPR基因进行特征性分析，结果显示，Pj-CPR基因核酸序列长度为291 bp，蛋白分子质量为11.93 ku，含有一个编码97个氨基酸的完整ORF，其中有强酸氨基酸14个，强碱氨基酸14个，疏水氨基酸26个和极性氨基酸34个，等电点为7.304。

用SignalP和SecretomeP软件对基因编码蛋白的信号肽序列进行预测和非典型分泌蛋白分析，结果Pj-CPR存在信号肽序列，且SecretomeP软件预测中NN-Score=0.860，属于分泌蛋白(图1)。用BepiPred软件预测基因编码蛋白抗原表位，结果表明，Pj-CPR蛋白存在5个抗原表位，分别为STGNTNELE(aa 20-28)、LG(aa 39-40)、EQLR(aa 42-45)、QYSKPDADANL(aa 57-67)、ERYKRGEETYE(aa 87-97)，表明Pj-CPR编码的分泌性蛋白具有较好抗原性。

图1 Pj-CPR基因信号肽序列分析Fig.1 The analysis of signal peptide sequence of Pj-CPR gene

用TMHMM和TargetP软件对基因进行蛋白跨膜区预测和蛋白亚细胞定位分析，并分析跨膜蛋白中氨基酸在胞外区、跨膜区和胞内区的数量。结果显示，Pj-CPR不是跨膜蛋白，且整个蛋白均位于胞外(图2)；在TargetP软件预测中由于信号肽的存在，该蛋白也被定位到分泌途径中。

图2 Pj-CPR蛋白跨膜区分析Fig.2 The analysis of Pj-CPR transmembarne domain

2.2 目的基因的克隆及重组表达质粒的鉴定

以斯氏副柔线虫RNA反转录产物为模板，采用特异性引物对Pj-CPR基因进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，获得了约291 bp的特异性条带，与预期大小相符(图3)。经PCR鉴定为阳性的重组表达菌，提取质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切，得到了约291 bp的片段，表明Pj-CPR基因已插入到表达载体pET30a(+)上(图4)。

M.DNA标准DL 2000；1、2.Pj-CPR基因；3.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000; 1，2.RT-PCR products of Pj-CPR gene; 3.Negative control

图3 Pj-CPR基因RT-PCR产物电泳

Fig.3 Electrophoresis of RT-PCR products of Pj-CPR gene

M.DNA标准DL 2 000；1～3.pETCPR载体 M.DNA Marker DL 2 000；1-3.pETCPR vector图4 表达载体pETCPR酶切鉴定结果Fig.4 Enzyme digestion results of pETCPR

2.3 序列分析

将斯氏副柔线虫Pj-CPR基因克隆载体和表达载体测序结果同转录组测序基因序列进行比较。结果表明，Pj-CPR基因序列与转录组测序的序列完全一致，说明成功构建了该基因的原核表达载体。

2.4 重组菌诱导表达

重组表达菌BL21(pETCPR)经IPTG诱导表达后，SDS-PAGE电泳检测，与BL21(DE3)空菌和空载体转化菌BL21(pET30)相比，出现了特异性目的基因融合蛋白表达带，与预期结果一致(图5)。分析其超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大部分在沉淀中，表明目的蛋白主要是以包涵体的形式表达(图6)。

M.蛋白分子质量标准; 1.BL21(DE3)空菌; 2.BL21(pET30)诱导前; 3.BL21(pET30)诱导后; 4～6.BL21(pETCPR)在25℃、30℃和37℃下诱导表达

M.Protein molecular weight Marker; 1.BL21(DE3)；2.Before induced BL21(pET30)；3.After induced BL21(pET30);4-6.BL21(pETCPR) induced at 25℃,30℃ and 37℃ respectively

图5重组菌诱导表达电泳结果

Fig.5 Electrophoresis of expression products of recombinant bacteria

M.蛋白分子质量标准;1. BL21(pETCPR)裂解上清; 2. BL21(pETCPR)裂解沉淀

M.Protein molecular weight Marker; 1.Supernatant of the lysate of BL21(pETCPR)；2.Pellets of the lysate of BL21(pETCPR)

图6 rCPR表达形式的电泳结果

Fig.6 SDS-PAGE analysis of rCPR expression inE.coli

2.5 重组蛋白Western blot分析

重组Pj-CPR蛋白(简称rCPR)Western blot结果表明，重组蛋白rCPR与阳性血清在17.6 ku处出现了特异性显色带，阴性血清对照在相应位置无显色条带(图7)。说明rCPR能够与斯氏副柔线虫感染骆驼血清中的IgG特异性结合，具有较好的免疫活性。

M.蛋白分子质量标准；1、2.阳性血清；3.阴性血清

M.Protein molecular weight Marker；1，2.Positive serum;3.Negative serum

图7 rCPR Western blot检测结果

Fig.7 Western blot analysis of the rCPR

3 讨论

高通量测序分析技术是近年来发展起来的一种高效的研究手段，促进了生物学研究领域的快速发展[8]。在寄生虫的研究上，也得到了广泛的应用[9-10]，寄生虫的一些分泌性蛋白同源物，如氨肽酶类、蛋白酶类及毒性分泌物等，被认为是与寄生虫免疫相关的抗原蛋白，具有免疫原性，在寄生虫免疫调节、免疫逃避及寄生虫与宿主互作中起关键作用[11-14]。这些功能性抗原可以为筛选疫苗抗原、发掘药物靶点及确定诊断抗原提供依据[15-16]。目前，国内外未见关于斯氏副柔线虫病免疫学诊断和免疫防控的研究报道。本研究所选的半胱氨酸蛋白酶Pj-CPR基因是在斯氏副柔线虫转录组和蛋白质组学分析的基础上，结合其他相关线虫的免疫学候选基因研究，筛选出的一种免疫候选基因[17]。生物信息学分析表明，斯氏副柔线虫Pj-CPR基因编码产物注释功能为半胱氨酸蛋白酶，是一种具有信号肽序列的分泌蛋白。蛋白跨膜区预测和蛋白亚细胞定位分析表明，该蛋白属非跨膜蛋白，主要位于胞外；抗原表位预测有5个抗原表位，具有较好的抗原性。通过生物信息学分析，斯氏副柔线虫Pj-CPR基因符合寄生虫免疫学诊断和免疫防控候选基因的特点。

本研究从斯氏副柔线虫中克隆了Pj-CPR基因并构建了该基因的原核表达载体，测序结果表明克隆的基因与转录组测序结果一致，成功构建了该基因的原核表达载体。原核表达载体转入大肠埃希菌BL21(DE3)后，以IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳结果表明，与BL21(DE3)空菌和含有pET30a(+)空载体的BL21(pET30a)相比，获得了预期大小的重组蛋白表达。Western blot结果证实了重组Pj-CPR蛋白能够与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中的抗体特异性结合，而与未感染斯氏副柔线虫的骆驼血清不发生反应，说明所获得的重组蛋白为斯氏副柔线虫Pj-CPR基因重组蛋白，该基因编码产物，在自然感过程中能够刺激宿主产生特异性抗体。由于该基因在GenBank中与常见反刍动物寄生虫基因比较为该病原特有基因，是一种具有重要生物功能的蛋白酶，所以该基因可以作为斯氏副柔线虫的免疫学诊断和防控的候选基因。研究结果可为家畜，特别是骆驼斯氏副柔线虫相关研究奠定基础。

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