赤土茯苓苷对运动后小鼠应激性胃溃疡的保护作用

冯小东

(西安石油大学体育系，陕西西安 710065)

适当的运动能够使人机体免疫力增强，还能调节心理情绪，从而促进身心健康。应激性胃溃疡是指机体创伤或者严重全身感染时引发的急性胃炎，属于一种急性胃黏膜病变[1]。近年来，应激性胃溃疡的发病率越来越高。对应激性胃溃疡的防治是当务之急。土茯苓(Smilaxglabra)是一种天然中药材，是隶属于百合科的干燥根茎。赤土茯苓是土茯苓的一种，医学上常用作解毒等。赤土茯苓苷(Smiglabrin)是从赤土茯苓中提取并分离出来的一种单体黄酮苷类有效成分，研究发现赤土茯苓苷对应激性胃溃疡有保护作用[2-4]。本文选取60只雄性小鼠，随机分为生理盐水组、草药组、粗品组及3组赤土茯苓苷组(SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组)，连续灌胃10 d后观察小鼠胃部的溃疡情况，评价6组小鼠胃黏膜出血量、胃黏膜Se-GSH-Px活性以及显微镜下胃部溃疡指数和出血点数。通过5个指标来讨论赤土茯苓苷对运动后应激性胃溃疡的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 赤土茯苓，购自安国市华仁药材有限公司；甲醛、乙酸乙酯、乙醇、石油醚、聚酰胺粉、甲醇，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 实验动物 选取出生2个月以上，体重在23.1 g～27.2 g的成年小鼠60只，雄性，品系为C57BL/6。

1.1.3 主要设备 解剖镜(奥林巴斯解剖镜SZX16型)，购自上海赖氏电子科技有限公司；显微镜(SEZ-300体视显微镜)，购自深圳市法尼奥科技有限公司；紫外分光光度计(752N)，购自上海科晓科学仪器有限公司；石蜡组织切片机(202c)，购自邢台慧思科技有限公司；H.H.S电热恒温水浴锅，上海医疗器械五厂生产。

1.2 方法

1.2.1 粗品制备 将购置的赤土茯苓直接用粉碎机粉碎后用乙醇反复提取7次，将滤液合并减压回收。取一部分减压回收物用甲醇重结晶得到粗品。

1.2.2 赤土茯苓苷制备 ①粗品制备剩余滤液减压回收物收集备用；②将粗品提取过程中所得滤渣用乙醇重新提取7次，冷却后过滤，将滤液合并减压回收；③将第1、2步骤所得减压回收物分别同时处理，在减压回收物中加入5倍水稀释后用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯萃取得萃取液。随后，将两部分萃取液合并，继续减压浓缩；④将③所得物用聚酰胺粉搅拌均匀，湿法上柱，水和乙醇梯度洗脱合并相同部分收集物，减压回收溶剂，甲醇重结晶，所得提取物经色谱分析检测即为赤土茯苓苷[5]。

1.2.3 试验方案 将小鼠随机分为6组，生理盐水组、草药组、粗品组及3组赤土茯苓苷组(SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组)。生理盐水组每次服用生理盐水2 mL，草药组每次服用300 mg直接粉碎的赤土茯苓，粗品组每次服用300 mg制备粗品，赤土茯苓苷组又分为SmiⅠ组给药量300 mg、SmiⅡ组给药量200 mg和SmiⅢ组给药量100 mg。人为给小鼠制造水浸应激环境，全部小鼠连续灌胃给药10 d，第10次灌胃后让小鼠禁食24 h，再进行灌胃给药1次，随后将全部小鼠四肢固定浸在电热恒温水浴锅中，使水面处于小鼠剑突部，水温设置为21℃，24 h后松开小鼠四肢后处死，先将0.5 mL 10 mL/L甲醛溶液注入到小鼠胃里，15 min后将小鼠胃取出。随后沿着胃大弯处解剖，小心清洁胃部内容物，首先测定GMBF，后置于载玻片上展平观察整个胃部出血点以及溃疡指数。

1.2.4 测定指标

1.2.4.1 溃疡抑制率 溃疡抑制率[6]为对照组的溃疡指数与试验组之差占对照组溃疡指数的百分比。公式：溃疡抑制率=(空白组溃疡指数-给药组溃疡指数)/空白组溃疡指数〕×100%

1.2.4.2 胃黏膜Se-GSH-Px活性 DTNB法观察胃黏膜GSH水平能够有效评价小鼠胃部脂质过氧化反应情况。

1.2.4.3 胃黏膜血流量GMBF 用LDF100C激光多普勒血流测定模块得TSD143表面型探头分别置于溃疡边缘面的4个不同部位，每个部位1 min，测定4个数据的平均值为胃黏膜血流量，结果以血流灌注单位BPU表示[7]。

1.2.5 切片制作方法 用针管先将10 mL/L的甲醛0.5 mL注入胃中，15 min后取胃，沿胃大弯剖 开，缓慢冲净胃内容物，放于载玻片上展平，取腺胃部制作切片，HE染色，病理组织观察。

1.2.6 数据统计分析 采用SPSS13.0统计分析软件进行分析，所有数据以均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 赤土茯苓苷对水浸应激所致小鼠胃溃疡的影响

每个小鼠都进行应激环境处理，将每组10只小鼠的胃溃疡指数和出血点数均取平均值汇总如表1所示。从表1中可以看出，SmiⅠ组、SmiⅡ组和SmiⅢ组的溃疡指数和出血点都明显低于其他3组，草药组和粗品组的溃疡指数低于生理盐水对照组。

从6组小鼠胃部溃疡指数分布图1可以发现，每组间10只小鼠的溃疡指数并无显著规律，说明具有可比性。

2.2 赤土茯苓苷对小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性的影响

试验中小鼠给药赤土茯苓苷均经过提取与分离制备的纯品，提纯后的药品经成分测定后确定为赤土茯苓苷。从表2中可以看出，SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组给药赤土茯苓苷，与生理盐水对照组相比，小鼠Se-GSH-Px活性水平明显升高(P<0.05)。分别对SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组给予不同赤土茯苓苷药量干预后，小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性升高情况不同，其中给予300 mg赤土茯苓苷的药量对小鼠体内超氧自由基的清除效果最好，间接说明水浸应激环境形成的胃溃疡改善效果最明显。草药组和粗品组虽然也在给予赤土茯苓干预，但是这2组小鼠的谷胱甘肽过氧化物酶活性升高幅度不明显，试验结果显示赤土茯苓直接灌胃和粗品灌胃的胃溃疡保护效果不佳。

表1 赤土茯苓苷对水浸应激所致小鼠胃溃疡的影响

注：*P<0.05 **P<0.01。

Note：*P<0.05 **P<0.01.

图1 6组小鼠胃部溃疡指数分布图Fig.1 Gastric ulcer index distribution in six groups of mice表2 赤土茯苓苷对小鼠胃黏膜Se-GSH-Px活性的影响Table 2 Effects of Smilax glabra glycosides on gastric mucosa Se-gsh-px activity in mice

组别Groups剂量/mgDose小鼠数Mouse№Se⁃GSH⁃Px/(U/min·mg)生理盐水组Salinegroup—102．05±0．47草药组Herbalmedicinegroup300102．13±0．62粗品组Crudeproductgroup300102．25±0．53SmiⅠ组SmiⅠgroup300102．83±0．72∗SmiⅡ组SmiⅡgroup200102．53±0．54∗SmiⅢ组SmiⅢgroup100102．80±0．74∗

注：*P<0.05 **P<0.01。

Note：*P<0.05 **P<0.01.

2.3 赤土茯苓苷对小鼠GMBF含量的影响

对照组和试验组小鼠的GMBF情况如表3所示。试验中小鼠给药赤土茯苓苷均经过提取与分离制备的纯品，提纯后的药品经成分测定后确定为赤土茯苓苷。本研究中对60只小鼠胃黏膜血流量的平均值做以对比，由表3中可以看出，生理盐水组的GMBF平均值明显低于试验组的平均值，说明生理盐水组的小鼠胃溃疡程度要明显重于SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组，间接说明赤土茯苓苷能够有效缓解应激性胃溃疡的病情。SmiⅠ组、SmiⅡ组、SmiⅢ组中，不同的给药量为小鼠的胃黏膜血流量控制带来不同的效果，其中给药量300 mg组的胃黏膜血流量最大，说明该组10只小鼠基本能够满足胃溃疡治愈的需求。草药组和粗品组各组平均胃黏膜血流量水平有所升高，但是远远达不到保护应激性胃溃疡的作用，虽然同样给予小鼠300 mg的药量，但是试验效果却差别甚远。表明300 mg赤土茯苓苷对应激性胃溃疡的保护效果最明显。

表3 赤土茯苓苷对小鼠GMBF的影响

注：*P<0.05。

Note：*P<0.05.

2.4 显微镜下观察小鼠胃部溃疡治愈情况

由图2可见，显微镜下观察解剖展平后的小鼠胃部显示，综合60只小鼠的胃部情况，生理盐水对照组的溃疡处黏膜层细胞脱落明显，胃壁肌肉层出现断裂的现象，黏膜下层有少许水肿并且伴有少量浆膜下轻微水肿。在溃疡周围的胃黏膜细胞出现变性的症状，毛细血管也有些许破裂，小动脉内有血栓现象。

赤土茯苓苷试验组的30只小鼠显微镜下结果表现为，溃疡处黏膜层细胞有脱落的现象，但是胃壁肌肉层是完整的没有出现断裂状况，黏膜下层和浆膜下的细胞也没有看到水肿等病变。在溃疡周围的胃黏膜细胞，试验组的30只小鼠基本表现为细胞疏松，有小部分细胞脱落，黏膜下层少许水肿，但是肌肉层以及浆膜层无明显病变。

A.生理盐水组；B.草药组；C.粗品组；D. SmiⅠ组；E. SmiⅡ组；F. SmiⅢ组 A. Normal saline group；B.Herbal medicine group；C.Crude product group；D.Smi Ⅰ group；E.Smi Ⅱ group；F.Smi Ⅲ group图2 小鼠胃组织病理学切片(HE染色)Fig.2 Histopathological sections of stomachs in mice(HE staining)

3 讨论

水浸应激所致胃溃疡，主要是胃黏膜下层微小动脉痉挛以及毛细血管有血栓形成导致胃黏膜下层微循环障碍，组织缺血、缺氧、细胞变性坏死，进而微小血管破裂出血，黏膜屏障消失，H+反流而不能被有效清除。微循环障碍时胃黏膜氧自由基清除酶系统活性降低，而白细胞等激活产生的自由基增加，从而使自由基聚积造成组织细胞损害。

研究发现，赤土茯苓粗提物对胃溃疡有一定的保护作用，但是对胃溃疡的保护作用远不及赤土茯苓苷的作用。这说明经过11次对小鼠灌胃赤土茯苓苷对应激性胃溃疡起了保护作用。赤土茯苓苷对水浸应激所致小鼠胃溃疡的干预，给药量不同，溃疡抑制的效果也不同，300 mg剂量赤土茯苓苷干预组的溃疡抑制率最高，溃疡指数和出血点数2个指标与对照组的差异最大，在6组中最低(P<0.01)。说明赤土茯苓苷300 mg的干预能够很好地对水浸应激性胃溃疡起到保护作用。

应激性胃溃疡的形成原因主要是攻击因子和防御因子系统失衡。攻击因子包括胃部胃酸过多的腐蚀、代谢中氧自由基的损伤及药物等化学物品对胃黏膜的损害。其中代谢中氧自由基过多则需要更多谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GSH-Px)消除自由基给机体造成的损害。小鼠水浸应激环境下，体内的脂类过氧化效应明显。这是由于应激反应使得小鼠儿茶酚胺水平增高，进而激化氧自由基。超氧自由基拥有活性非常强的氧化因子，对细胞膜结构的维持有重大意义的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化反应，从而损伤线粒体等细胞，最终导致胃黏膜损伤，造成胃溃疡的形成[6]。

胃黏膜血流可为胃黏膜细胞的新陈代谢提供氧和丰富的营养元素，以维持细胞功能的有效运行和结构的完整性。胃黏膜血流量还能带走反渗透进入胃黏膜中的氢离子，以此维持组织细胞内酸碱性处于正常范围。但凡胃黏膜内的平衡系统发生变化，胃黏膜血流量就会相应改变。一旦引起胃黏膜血流量的减少，就直接导致细胞的氧供应不足，造成胃黏膜缺血甚至形成溃疡面。早前就有学者的研究认为应激刺激使得交感神经异常兴奋，致使机体分泌更多儿茶酚胺，最终导致为小血管痉挛性收缩，胃黏膜出血量降低[7]。

结果显示，赤土茯苓苷给药组能够减少胃黏膜的脂质过氧化反应，试验组谷胱甘肽过氧化物酶活性明显高于对照组，说明赤土茯苓苷抗氧化及清除自由基的作用与胃黏膜的保护有关。赤土茯苓苷能抑制血小板聚积，促其解聚，抗血栓形成。这对改善胃黏膜微循环、防止微血管破裂出血有非常重要的意义。

参考文献:

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[4] 赵党生，徐兰萍，王凤仪.基于文献的胃溃疡中医用药规律研究[J].甘肃中医药大学学报，2016，32(5)：58-62.

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