两种新城疫灭活疫苗免疫原性比较

楚电峰，徐慧琳，薄智勇，刘秋云，李 娜，刘相娥

(青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛 266114)

新城疫(Neweastle disease，ND)是由新城疫病毒(Neweastle disease virus，NDV)引起的一种接触性、高致死率的传染病，是养禽生产中危害最严重的疫病之一[1]。近年来，国内接种NDV活疫苗和灭活苗的鸡群中，仍时有新城疫的发生，其重要的原因可能是免疫鸡群中存在免疫失败的现象[2]。随着免疫压力的不断增大、变异株的不断出现，原有的疫苗免疫效果发挥不了明显的作用[3]。NDV经历了大量的遗传进化，发展成几个不同的基因型(Ⅰ～Ⅸ)，不同类型的NDV其毒力相差很大，在这些基因型中，基因Ⅶ型被认为是在20世纪90年代引起西欧[4]、非洲南部、欧洲南部[5]和东亚严重疫情的罪魁祸首，目前，基因Ⅶ型NDV仍然在中国盛行[6]。我国目前常用的传统疫苗毒株La Sota、Clone 30、V4等均属于经典型基因Ⅱ型和Ⅰ型毒株，而造成目前新城疫广泛流行的野毒株多属于基因Ⅵ型和Ⅶ型[6]。免疫效果不仅与疫苗质量、免疫程序有关，而且与新城疫毒株的变异、不同基因型毒株的出现有密切关系[7]。因此，对新城疫不同基因型毒株进行免疫原性研究，将对新城疫疫苗的发展和疾病防控发挥至关重要的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 基因Ⅶ型A-Ⅶ株油乳剂灭活疫苗，制苗前抗原HA效价为1∶1 024；基因Ⅱ型La Sota株油乳剂灭活疫苗，制苗前抗原HA效价为1∶1 024，均来自青岛易邦生物工程有限公司。

1.1.2 检测抗原 基因Ⅶ型检测抗原，HA效价为1∶1 024，来自青岛易邦生物工程有限公司；基因Ⅱ型La Sota株检测抗原，HA效价为1∶1 024，来自中国兽医药品监察所。

1.1.3 攻毒毒株 基因Ⅶ型强毒YND株，效价为108.17ELD50/0.1 mL，来自青岛易邦生物工程有限公司；新城疫标准强毒F48E9株，效价为108.17ELD50/0.1 mL，来自中国兽医药品监察所。

1.1.4 试验用动物和鸡胚 21日龄SPF鸡，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；非免疫鸡胚，来自青岛易邦生物工程有限公司；SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫接种 21日龄SPF鸡30只随机分为A、B、C 3组，试验组A、B和对照组C各10只，A、B两组分别用基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株油乳剂灭活疫苗颈部皮下免疫接种21日龄SPF鸡各10只，20 μL/只，健康对照组不免疫。试验组免疫接种后7、14、21、28 d分别采血，对照组21 d和28 d分别采血，分离血清，按照2015版《中华人民共和国兽药典》附录3404，测定血清中新城疫的HI抗体。

1.2.2 攻毒 免疫后21 d，2组试验鸡及对照鸡均随机均分，根据2015版《中华人民共和国兽药典》鸡新城疫灭活疫苗攻毒方法，分别肌肉注射基因Ⅶ型强毒YND株和标准强毒F48E9株0.5 mL(含105.0ELD50/只)，攻毒后每天观察试验鸡发病死亡情况，连续观察14 d。

1.2.3 病毒分离 攻毒后第3、5、7天分别采喉头和泄殖腔拭子，于装有1 mL含双抗生理盐水的1.5 mL离心管中(双抗单位为2 000 UI/mL)，冻融3次，振荡后离心取上清，经尿囊腔接种10.5日龄非免疫鸡胚，5枚/样品，置37℃，湿度60%孵化箱中，培养72 h，弃去24 h内的死胚，收获尿囊液进行HA检测，在每个样品接种的5枚鸡胚中，有1枚尿囊液HA为阳性(≥1∶128)判为病毒分离呈阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。

1.2.4 病毒载量测定 取病毒分离呈阳性的胚液做病毒滴度测定(EID50)。对收获的免疫组尿囊液做10-1～10-3稀释；对照组做10-3～10-6稀释，经尿囊腔接种10.5日龄 SPF鸡胚，5枚/稀释度，置37℃，湿度60%孵化箱中，孵育120 h，弃去24 h内死胚，收获尿囊液按照2015版《中华人民共和国兽药典》附录3402，测定EID50。

2 结果

2.1 免疫后抗体水平检测结果

在免疫接种后第7、14、21、28天后分别采血，分别以基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株为抗原检测两种疫苗免疫后四周内血清抗体消长规律，结果如表1所示，随着时间的延长，试验A、B两组抗体水平均呈递增趋势，且未免疫对照组未检测到明显抗体水平，说明两种疫苗均能引起明显的免疫反应。免疫后7 d两组抗体水平出现差异，14 d后基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫组以A-Ⅶ抗原检测得抗体水平明显高于基因Ⅱ型La Sota株免疫组以La Sota抗原检测的抗体水平，说明基因Ⅶ型A-Ⅶ株的免疫原性更好。

表1 免疫后抗体水平检测 (log2)

2.2 攻毒后免疫保护结果

结果如表2所示，免疫21 d后攻标准强毒F48E9株和基因Ⅶ型强毒YND株，2种疫苗针对2株强毒均能提供100%的临床保护，2组免疫组鸡精神、食欲均正常。对照组鸡攻毒后2 d，表现出精神不振、排黄绿色粪便，3 d～5 d均死亡。

表2 攻毒后临床观察保护效果

2.3 攻毒后病毒分离结果

分别用基因Ⅶ型强毒YND株和标准强毒F48E9株攻毒，采棉拭子测定排毒情况如表3所示， 对F48E9的攻击，在喉头排毒方面，基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫鸡第3天有1只鸡检测到排毒，La Sota株疫苗免疫鸡第3天3只鸡检测到排毒；泄殖腔排毒方面，基因Ⅶ型A-Ⅶ株和基因Ⅱ型La Sota株疫苗免疫鸡均未检测到排毒。对于基因Ⅶ型强毒YND株的攻击，2种疫苗则呈现出了明显的差异，基因Ⅶ型A-Ⅶ株免疫鸡喉头及泄殖腔均未检测到排毒；La Sota株疫苗免疫鸡，在喉头排毒方面，第3天和第5天均有5只鸡均检测到排毒，在泄殖腔排毒方面，第5天有3只鸡排毒。对照组未免疫鸡第4至5天全部死亡。结果表明，在标准强毒F48E9株和基因Ⅶ型强毒YND株攻击下，基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗抑制病毒复制和排毒的效果明显优于传统基因Ⅱ型La Sota株疫苗。

2.4 病毒载量测定

通过棉拭子测定排毒情况，对采集的阳性样品进行EID50的测定，结果如表4所示，免疫基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗的鸡，攻击标准强毒F48E9株，喉头排毒测得病毒载量EID50为101.17/0.1 mL，攻击基因Ⅶ型强毒YND株作，未检测到排毒感染，而免疫La Sota株疫苗的鸡，以F48E9攻毒，检测喉头排毒载量EID50为101.31/0.1 mL。而以YND攻毒，检测喉头第3天排毒载量EID50为101.45/0.1 mL，第5天为101.03/0.1 mL，检测泄殖腔第3天的排毒载量EID50为101.42/0.1 mL，上述结果说明基因Ⅶ型A-Ⅶ株灭活疫苗比基因Ⅱ型La Sota株灭活疫苗更有效的减少了病毒在鸡体内的复制、繁殖与排毒。

表3 攻毒后病毒分离结果

表4 两种疫苗免疫攻毒后病毒载量测定

3 讨论

新城疫是禽副黏病毒引起的主要传染病之一，目前疫苗免疫接种是防控新城疫的最主要措施，在我国，虽广泛使用新城疫疫苗进行免疫，但新城疫疾病仍不断发生，主要由于NDV不同基因型毒株间的毒力和抗原性有一定的差异，所以采用与最新分离毒株同源性高的毒株作为疫苗株，加强对鸡群新城疫的预防免疫，可能能有效的控制野毒株在鸡群中的传播[8]。刘华雷等[9]通过对不同地区筛选的具有代表性的16株NDV对其F基因重要的功能区片段进行克隆及序列分析发现，16株分离株中13株为基因Ⅶ型。流行病学数据也充分证明当前Ⅶ亚型在我国流行强毒株中占有绝对优势[1]。本文通过比较基因Ⅶ型A-Ⅶ株制备的疫苗与传统的基因Ⅱ型La Sota 株所制备的灭活疫苗对免疫鸡的抗体效价影响发现，基因Ⅶ型A-Ⅶ株所产生的HI抗体效价明显高于La Sota株灭活疫苗组。通过攻毒试验结果分析，无论对于F48E9的攻击还是YND的攻击，基因Ⅶ型A-Ⅶ株疫苗免疫鸡和基因Ⅱ型La Sota株灭活苗免疫鸡，均能提供100%的临床保护。但基因Ⅶ型A-Ⅶ株灭活苗比基因Ⅱ型La Sota株灭活苗能够更好的抑制两种毒株病毒在体内的复制和排毒。目前，广泛应用的新城疫基因Ⅱ型La Sota株灭活苗对流行的基因Ⅶ型病毒仍能提供良好的免疫保护[10]，但仅仅是从保护鸡群不发病的角度来评价，这种评价方式可能并不全面，因为La Sota株灭活苗免疫后不能完全抑制基因Ⅶ型病毒在体内的复制和排毒，也可能在鸡群抵抗力低下时引发感染[11]。新城疫传统疫苗毒株与流行毒株之间存在一定的毒力和抗原方面的差异，我国新城疫的发生和流行除了关注经典毒株致病外，还应重视NDV基因Ⅶ型毒株在自然界的广泛存在，才能更好地控制疫病的发生，保障家禽养殖业的健康发展。

参考文献:

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[3] 王永坤，严维巍．鸡副粘病毒病的病毒特性和基因型研究及疫病防制[J]．扬州大学学报：自然科学版，2000，3(2)：25-29．

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[5] Herczeg J,Wehmann E,Bragg R R,et al.Two novel genetic groups (Ⅶb and Ⅷ) responsible for recent Newcastle disease outbreaks in Southern Africa,one (Ⅶb) of which reached Southern Europe[J].Arch Virol,1999,144:2087-2099.

[6] 赵 雯,刘瑞菊,孙军峰,等.表达基因Ⅶ型新城疫病毒F蛋白重组LaSota疫苗株的构建[J].中国预防兽医学报,2017,39(5):407-411.

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[9] 刘华雷，王永坤，严维巍，等．我国部分地区新城疫病毒的流行现状分析[J]．中国兽医学报，2003，23(3)：218-221．

[10] 王友令，怀 英，李 莉，等．新城疫La Sota疫苗对不同基因型流行株的免疫保护[J]．浙江农业学报， 2009，21(5)：446-449．

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