猪流行性腹泻病毒经典株与变异株高分辨率熔解曲线方法的建立

刘向楠，饶 丹，丛 锋，练月晓，曾繁文，黄 韧，张 钰，郭鹏举，罗满林，陈梅丽*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642；2.广东省实验动物监测所，广东广州 510663；3.广东省实验动物重点实验室，广东广州 510663)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，该病的主要特征是急性水样腹泻、呕吐和脱水死亡；各种年龄阶段的猪均易感，尤其对1周龄～2周龄哺乳仔猪危害最为严重，病死率高达90%～100%，给养猪业造成了极大的经济损失[1]。亚洲一些国家如泰国、韩国、越南及中国多次报道了PED[2]。美国于2013年4月出现PED疫情并快速蔓延到整个国家，截止2014年底已累计造成至少 800万头新生仔猪死亡，经济损失高达18亿美元[3]。

PEDV属于冠状病毒科，为单股正链RNA病毒，基因组全长约 28 kb，纤突蛋白(S)是S基因编码的位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，具有高度免疫原性和反应原性，是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白，也是研发PEDV疫苗的一个主要候选蛋白[1,4]。S蛋白主要用来研究不同毒株的遗传关系和多样性，以及遗传变异和病毒功能之间的关系。通过氨基酸序列比对发现，与PEDV早期毒株和疫苗株等经典毒株相比，近年来在中国、美国、韩国流行株的PEDV变异株突变集中在S基因的N端，在56-59 aa和144 aa处存在氨基酸的缺失，27-30、61-64、68-72、81-89、160-167、201-207 aa存在连续超过4个氨基酸的突变。这些缺失或突变可能是PEDV近年暴发流行的原因[5]。本研究基于PEDV经典毒株和变异流行株在S基因序列的差异，建立了一种PCR结合高分辨率熔解曲线(high resolution melting-curve，HRM)分析技术方法，该方法能够在实验室中简单、快速、低成本地鉴别PEDV经典毒株与变异毒株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和临床样本 CV777疫苗株作为经典毒株代表株，GD株(由广东省实验动物监测所分离并保存)作为变异株代表株；2011年-2016年于广东省收集的10份腹泻仔猪小肠内容物作为临床样本。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV) 经典毒株CH-1R、伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus， PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2，PCV2)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)均为疫苗株，购自广东省动物防疫物资储备中心;猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、A群猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪德尔塔冠状病毒 (Porcine delta coronavirus, PDCoV)由华南农业大学马静云教授惠赠;猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)核酸由青岛农业大学尹燕博教授惠赠。

1.1.2 主要试剂和仪器 pMD-19T载体、一步法反转录PCR试剂盒、DNA Marker，宝生物工程(大连)有限公司产品；E.coliDH5α、核酸提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；饱和染料LC Green，BioFire公司产品；荧光定量PCR仪(Rotor-Gene Q)，德国凯杰公司产品。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 小肠内容物用适当量PBS混匀，以3 000 r/min离心，取上清200 μL用于抽提核酸。PEDV GD株接Vero细胞培养48 h后，收获病毒，细胞及上清经3次冻融，取200 μL用于抽提核酸。商品疫苗株使用稀释液溶解，取200 μL用于抽提核酸。用天根核酸自动抽取仪及配套试剂盒分别提取猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、高致病性毒株、天津疫苗株及临床组织样本中的RNA。

1.2.2 引物的设计与合成 应用Oligo6.0软件比对17株PEDV毒株的S基因序列，根据变异流行株与经典毒株S基因的缺失位点两侧设计引物，PEDV引物P1:CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG；PEDV引物P2：ATACCATGAACGCCACTA。

1.2.3 一步法RT-PCR-HRM扩增体系及条件 通过对引物RT-PCR反应条件及反应体系的优化，确定了PCR最佳反应体系。DNA反应体系为20 μL：核酸模板 2 μL，2×Premix HSTaq10 μL，上游引物P1 (10 μmol/L)0.5 μL，下游引物P2 (10 μmol/L)0.5 μL， LC Green 1 μL，补水至20 μL。RT-PCR扩增反应程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 35 s；循环35次；72℃ 5 min。HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.3℃的速率从70℃～90℃进行荧光信号的收集。

1.2.4 特异性试验 采用建立的RT-PCR-HRM方法对猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)进行检测，验证该方法的特异性。

1.2.5 敏感性试验 将质粒标准品用Easy dilution(Takara公司)做10倍系列稀释，得到1×108～1×101copies/μL系列标准模板。利用优化后的反应体系和条件，以各稀释度质粒标准品为模板进行PCR扩增及HRM分析。

1.2.6 临床应用 应用建立的PCR-HRM方法10份对样本进行RT-PCR-HRM检测，每次反应同时设置阳性对照和阴性对照。通过PCR产物熔解曲线来判断结果。采用测序方法对部分阳性样本进行测序，对检测方法做进一步验证。

2 结果

2.1 PCR-HRM方法的建立

图1和图2分别是经典毒株与流行变异株的RT-PCR扩增产物标准化熔解曲线与峰型熔解曲线图。标准熔解曲线图中，疫苗株与野毒株存在明显的熔解曲线差异，野毒株的荧光信号减弱的起始温度与最后趋于0的温度明显小于疫苗株。对比峰型化熔解曲线，即荧光信号导数化熔解曲线，经典毒株的熔解曲线Tm值为83℃～83.5℃出现熔解峰，流行变异株扩增的熔解曲线在84.25℃～84.75℃出现熔解峰。通过标准化和峰型熔解曲线均能明显的区分经典毒株与流行变异毒株。

图1 PEDV经典毒株和变异毒株标准化熔解曲线Fig.1 Standard melting curves analysis of PEDV mutant strains and classic strains

图2 PEDV经典毒株和变异毒株峰型熔解曲线图Fig.2 Conventional melting curves of PEDV mutant strains and classic strains

2.2 特异性试验

使用P1/P2引物对CSFV、TGEV、PDCoV、PoRV、PCV2、PPV、PRV、PRRSV、FMDV与PEDV经典毒株和变异流行株一同进行RT-PCR。结果除PEDV具有目的条带外，其他病毒均无目的条带，表明建立的方法具有良好的特异性(图3)。

M.DNA标准50 bp;1.阴性对照；2.猪流行性腹泻病毒经典株；3.猪流行性腹泻病毒变异株；4.猪传染性胃肠炎病毒；5.Delta冠状病毒；6.猪圆环病毒2型；7.猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒；8.猪细小病毒；9.猪流感病毒；10.猪瘟病毒；11.口蹄疫病毒；12.猪伪狂犬病毒；13.猪轮状病毒

M.DNA Marker 50 bp；1.Negative control；2.PEDV classic strain；3.PEDV mutant strain；4.TGEV；5.Delta CoV；6.PCV2；7.PRRSV；8.PPV；9.SIV；10.CSFV；11.FMDV；12.PRV；13.PoRV

图3 PEDV毒株特异性试验

Fig.3 Specificity test of PEDV strains

2.3 敏感性试验

以质粒标准品拷贝浓度为1×108～1×101copies/μL为标准模板，在P1/P2引物为引物的反应体系扩增下评估RT-PCR-HRM方法的灵敏度，图4和图5分别是经典株与变异株阳性质粒样品的峰型化熔解曲线图，经典株阳性质粒从10-1稀释至10-8均出现了特异性的熔解峰，变异株阳性质粒从10-1稀释至10-9均出现了特异性的熔解峰。结果表明该方法的灵敏度较高，对经典株与变异株阳性质粒的最低检测限分别为1 350 copies/μL和192 copies/μL。

2.4 PCR-HRM在临床样本检测中的应用

利用PCR-HRM分析方法对10份临床样本进行检测，如图6所示，通过对图形的分析，发现其中有4份样本熔解峰出现在83℃～83.5℃，判定为猪流行性腹泻病毒经典株；另外6份样本熔解峰在84.25℃～84.75℃，判断为猪流行性腹泻病毒变异流行株。在99%置信区间，Tm值无交叉，两者差异极显著(P<0.01)。随机选择8份样品，测序结果与HRM分析结果一致。

图4 PEDV经典株质粒梯度熔解曲线峰型图Fig.4 Conventional melting curves of gradient plasmids of PEDV classic strains

图5 PEDV变异株质粒梯度熔解曲线峰型图Fig.5 Conventional melting curves of gradient plasmids of PEDV mutant strains

图6 高分辨率溶解曲线分析临床样本Fig.6 Analysis of clinical samples by PCR-HRM

3 讨论

自2010年起，中国主要养猪省份陆续暴发了PED，不同PEDV基因组全序列比对结果发现自2010年以后的流行毒株多个基因发生变异，表明此次中国乃至世界范围内流行的PED是由PEDV变异株引起的[6-8]；与此同时PEDV经典毒株仍存在。

传统的PEDV鉴定方法主要有病毒的分离培养、间接ELISA、双抗夹心胶体金、RT-PCR以及实时荧光定量RT-PCR等方法。其中病毒的分离培养为金标准，但Vero细胞加胰酶的方法分离PEDV困难，成功率低；分子生物学方法成为鉴定PEDV的主要方法，实时荧光定量RT-PCR相比普通PCR灵敏度高，目前在各实验室广泛使用。鉴定为PEDV阳性的样品，通常需要测序才能进一步确定为PEDV变异毒株还是经典毒株，该方法耗时久，费用高。

高分辨熔解曲线分析技术(HRM)是一种用于单核苷酸多态性(SNP)和基因分型研究的方法，该方法是简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，主要用于高通量的突变扫描和基因分型[9]。目前，在动物病原鉴别检测中报道逐年增加。

本研究根据PEDV经典毒株与变异株在S基因的175-185位缺失11个核苷酸,建立了RT-PCR-HRM方法用于鉴别PEDV经典毒株与变异株，该方法可以在2 h内鉴定毒株为经典毒株或是变异株，对CSFV、PRV、PPV和PRRSV等均无特异性扩增且灵敏度较高，在临床样品检测中验证该方法有效。PCR扩增产物可以在Rotor-Gene Q仪器上直接分析，无需开盖，避免了凝胶污染问题，同时也提高了分析的灵敏度。

RT-PCR-HRM方法克服了病毒分离鉴定、基因测序繁琐、成本高、耗时长的缺点，也解决了传统RT-PCR特异性低、灵敏性差的问题。既能检测发病动物机体感染PEDV是否为变异毒株，更能定性检测病料中PEDV的存在与否，极大地方便了生产中对PEDV区分是否为变异毒株的检测技术，也丰富了实验室对PEDV研究的内容。

参考文献:

[1] Sestak K,Saif L J,Morilla A,et al.Porcine coronaviruses[M].Trends in Emerging Viral Infections of Swine. Iowa State Press, 2008:321-330.

[2] Song D,Park B.Porcine epidemic diarrhoea virus:a comprehensive review of molecular epidemiology,diagnosis,and vaccines [J].Virus Genes,2012,44(2):167-175.

[3] Chen Q,Li G,Stasko J,et al.Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J].J Clin Microbiol,2014,52(1):234-243.

[4] Sun D B,Feng L,Shi H Y,et al.Spike protein region of porcine epidemic diarrhea virus is essential for induction of neutralizing antibodies[J].Acta Virologica,2007,51(3):149-156.

[5] 陈 静.猪流行性腹泻病毒变异株与经典疫苗株S蛋白免疫原性差异分析[D].河南郑州：河南农业大学,2015.

[6] Sato T，Takeyama N，Katsumata A，et al． Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptationinvitroand attenuation of virulenceinvivo[J]． Virus Genes ，2011，43:72-78.

[7] Park S J，Moon H J，Yang J S，et al.Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea[J]． Virus Genes，2007，35:321-332.

[8] Puranaveja S，Poolperm P，Lertwatcharasarakul P，et al． Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus，Thailand[J]． Emerg Infect Dis，2009，15:1112-1115.

[9] 陈 斌,雷秀霞,周小棉.高分辨率熔解曲线技术及其在分子诊断中的应用进展[J].分子诊断与治疗杂志 2009,1(2):120-124.