一种新的氧化应激特征性哮喘模型的建立

梁正敏，文雪梅，廖晓光,2，徐杨峰，颜国庆，邓 鑫，何家康*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西畜牧研究所，广西南宁 530001)

鼠类动物哮喘模型一直是国内外研究哮喘的重要手段和工具，目前国外多选用Balb/c小鼠来建立哮喘模型，多数以诱发哮喘气道炎症为目的。另外，有研究报道经肺吸入的过氧化氢(H2O2)对小鼠产生氧化损伤作用[1-2]。本研究在前期建立的哮喘模型[3]上进行了改进，用过氧化氢和卵清蛋白(ovalbumin, OVA)建立氧化应激特征性哮喘模型目的是为了模拟外源氧化性物质对哮喘的影响。摸索出了一种新的、效果良好的小鼠氧化应激特征性哮喘模型建立方法，为研制抗畜禽慢性呼吸道新兽药提供药效学研究方法和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 Balb/c小鼠，雌性，30只，SPF级，20 g±2 g，购自广东实验动物中心。合格证号：SCXK(粤)2013-0002，试验前适应性饲养1周。

1.1.2 药品与试剂 液态铝佐剂，Pierce公司产品；卵清蛋白(OVA)，Sigma公司产品；过氧化氢(H2O2)，成都科龙化工试剂公司产品；活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、BCA检测试剂盒，Beyotime公司产品；小鼠 IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 试剂盒，Neobioscience公司产品；总RNA提取试剂、RNA反转录试剂、荧光定量PCR试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 氧化应激特征性哮喘模型的建立 将30只18 g～20 g雌性 Balb/c小鼠随机分成3组，每组10只，分组如下：正常对照组(Cont)、OVA对照组(OVA)和氧化应激特征性哮喘模型组(OVA+H2O2)。在第 0、7、14天，除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射含液态铝佐剂的100 μg/mL OVA致敏液，每只小鼠0.2 mL，空白对照组的小鼠注射等量的PBS。在第22～27天，除正常对照组外，其余各组小鼠经乙醚麻醉后滴鼻2 mg/mL OVA激发液，每只小鼠50 μL，1 h后氧化应激特征性哮喘模型组小鼠滴鼻1 mL/L H2O2，每只小鼠50 μL，空白对照组小鼠滴鼻等量PBS。在最后1次滴鼻激发结束24 h后，收集血清、BALF及肺组织进行后续的试验。具体的试验方案见图1。

1.2.2 氧化应激特征性哮喘模型的评价 试验模型小鼠出现明显的鼻部搔痒、抓鼻、呼吸加快、点头呼吸、焦躁不安、嘴唇发绀等症状。空白组小鼠无明显症状。另外，氧化应激特征性哮喘小鼠肺脏组织学观察可见支气管腔内有大量炎性细胞和黏液分泌物，明显多于OVA单独激发对照组；氧化应激特征性哮喘模型组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13浓度极显著升高，且明显高于OVA对照组；肺组织中过氧化氢酶(Cata-lase，CAT)mRNA相对表达水平极显著低于空白对照组和OVA对照组，还原型辅酶Ⅱ氧化酶-2(NOX-2)mRNA相对表达水平极显著低于空白对照组和OVA对照组。通过以上结果可以判定氧化应激哮喘模型建立成功。

图1 小鼠氧化应激特征性哮喘模型建立方案Fig.1 Experimental protocol for development of characteristic asthmatic model of oxidative stress in mice

1.2.3 小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)的收集 小鼠在最后1次激发24 h后，乙醚过度麻醉处死小鼠，固定好小鼠，剪开小鼠颈部皮肤、分离并充分暴露气管，在气管上方做一“V”形切口，插入自制插管，用注射器注入 0.5 mL 预冷PBS，轻柔肺部组织，冲洗后吸出置1.5 mL的离心管中，重复3次，将肺泡灌洗液以3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，置-80℃冰箱保存用于测定肺泡灌洗液上清液中细胞因子含量。

1.2.4 病理组织学观察 小鼠末次激发24 h后，乙醚深度麻醉处死小鼠，解剖取出左肺叶，用PBS清洗，40 mL/L多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片展片、HE染色，光学显微镜下观察肺组织基本病理变化。

1.2.5 测定肺组织中ROS和SOD水平 准确称取左肺组织重量，用PBS清洗肺组织表面血迹，剪碎；按重量(g)∶体积(mL)=1∶20的比例加入预冷PBS，用超声破碎仪充分破碎至无可见组织块状态；4℃、1 000 r/min离心30 min，收集上清液，分装，取少量上清液用于总蛋白测定。其余上清液用于ROS和总SOD水平检测，按试剂盒说明书操作。

1.2.6 ELISA法测定BALF中IL-4、IL-5、IL-13浓度 用小鼠的IL-4、IL-5、IL-13 ELISA检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 RT-PCR检测肺组织CAT和NOX-2基因mRNA表达水平 小鼠末次激发24 h后，乙醚深度麻醉处死小鼠，解剖取出右肺叶，用预冷PBS洗去表面血迹，立即置于液氮中速冻，之后放于-80℃保存用于提取RNA。RNA提取、反转录和RT-PCR严格按照试剂盒说明书进行，所用引物如表1所示。

表1 荧光定量PCR所用引物

1.2.8 数据处理分析 用SPSS21.0软件进行分析，结果用平均值±标准差表示，组间比较采用单因素ANOVA分析及t检验。以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 过氧化氢对哮喘小鼠肺组织中ROS和SOD水平的影响

肺组织中炎症细胞产生的活性氧(ROS)在哮喘气道的发病机制和炎症反应中起重要作用。为了评估过氧化氢对OVA诱导的哮喘小鼠肺组织产生ROS的影响，测定了肺组织中的ROS水平。结果如图2所示，与空白对照组相比，氧化应激哮喘模型组肺组织中的ROS水平极显著升高(P<0.01)，且极显著高于OVA对照组(P<0.01)。基于以上试验结果，检测了肺组织中的抗氧化物酶如SOD水平。结果如图2所示，与空白对照组相比，氧化应激哮喘模型组SOD水平极显著低于空白组(P<0.01)，且显著低于OVA对照组(P<0.05)。表明H2O2能明显促进ROS的产生，明显抑制SOD的活性，严重破坏氧化/抗氧化平衡。

2.2 过氧化氢对哮喘小鼠BALF中细胞因子浓度影响

为了观察过氧化氢对OVA诱导的氧化应激哮喘小鼠BALF中Th2细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13分泌的影响，本研究用ELISA法检测了BALF中的细胞因子浓度。结果如图3所示，氧化应激哮喘模型组BALF的IL-4、IL-5、IL-13水平极显著高于空白组(P<0.01)，且IL-4和IL-5浓度显著高于OVA对照组(P<0.05)，IL-13浓度显著高于OVA对照组(P<0.01)。表明相对于OVA对照组，H2O2可明显促进IL-4、IL-5、IL-13的分泌(P<0.05)。

“#”表示与空白对照组比较差异极显著(P<0.01)；“*”表示与OVA对照组比较差异显著(P<0.05)，“**”表示与OVA对照组比较差异极显著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01); “*” indicates siginificant difference compared with OVA control group (P<0.05),“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

图2过氧化氢对哮喘小鼠肺组织中ROS和SOD的影响

Fig.2 Effects of H2O2on levels of ROS and SOD in lung tissues of asthmatic mice

“#”表示与空白对照组比较差异极显著(P<0.01)；“*”表示与OVA对照组比较差异显著(P<0.05)，“**”表示与OVA对照组比较差异极显著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01);“*” indicates siginificant difference compared with OVA control group (P<0.05),“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

图3过氧化氢对哮喘小鼠BALF中细胞因子浓度的影响

Fig.3 Effects of H2O2on concentrations of cytokines in BALF of asthmatic mice

2.3 过氧化氢对哮喘小鼠肺组织中CAT和NOX-2基因mRNA表达的影响

为了进一步验证过氧化氢对抗氧化物酶水平的影响，检测氧化应激肺组织中CAT mRNA相对表达水平。结果如图4所示，与空白对照组相比，氧化应激哮喘模型组CAT水平极显著低于空白组(P<0.01)，且极显著低于OVA对照组(P<0.01)。此外，本试验检测了氧化应激肺组织中促氧化因子NOX-2 mRNA相对表达水平。图4结果显示，氧化应激哮喘模型组NOX-2 mRNA水平极显著高于空白对照组(P<0.01)，且极显著高于OVA对照组(P<0.01)。

“#”表示与空白对照组比较差异极显著(P<0.01)；“**”表示与OVA对照组比较差异极显著(P<0.01)

“#” indicates extremely siginificant difference compared with normal control group (P<0.01);“**” indicates extremely siginificant difference compared with OVA control group (P<0.01)

图4过氧化氢对哮喘小鼠肺组织中CAT和NOX-2 mRNA表达的影响

Fig.4 Effects of H2O2on the mRNA expressions of CAT and NOX-2 in lung tissues of asthmatic mice

2.4 过氧化氢对哮喘小鼠肺脏病理组织学变化的影响

如图5所示，空白对照组小鼠肺泡壁结构完整，支气管和血管周围无炎性细胞浸润，OVA刺激的小鼠可见支气管和血管周围有大量以嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞为主的的炎性细胞浸润，且气道管腔狭窄，伴有炎性产物生成，经OVA和H2O2双重刺激的小鼠肺脏可见支气管内外有大量炎症细胞侵润，炎性细胞和分泌物堵住了整个支气管腔，炎性细胞数量明显比OVA对照组多。

3 讨论

目前，在哮喘发病机制中认为气道炎症和氧化应激与哮喘发病密切相关，也是近年来哮喘研究中的热点。氧化应激与气道炎症、气道高反应性、组织损伤和气道重塑等密切相关[4]。氧化应激是形成哮喘的大多数分子途径和机制的最终结果，会直接或间接地损伤肺组织，最终引起哮喘的不可逆损伤，形成气道重塑[4]。有研究报道氧化应激上调Th2介导的炎症反应，增加哮喘严重程度，增强了支气管高反应性，促使气道重塑形成[5]。目前，抗氧化治疗哮喘成为治疗哮喘的一个重要方向，因此，建立一种氧化应激特征性哮喘模型很有必要。本研究用过氧化氢与卵清蛋白联合激发建立氧化应激特征性小鼠哮喘模型，目的是为了更加明确外源性氧化剂在支气管哮喘中的作用，复制出一种更严重的哮喘模型，为临床抗氧化治疗支气管哮喘奠定研究基础。

A.空白对照组; B.OVA对照组; C.氧化应激哮喘模型组 A.Blank control group; B.OVA control group; C.Asthma with oxidative stress group图5 过氧化氢对哮喘小鼠肺组织病理变化的影响(上图为100×，下图为400×)Fig.5 Effects of H2O2 on pulmonary histopathology in lung tissues of asthmatic mice(The above figure 100×，the following figure 400×)

ROS信号在哮喘发病的初始和维持阶段起重要作用。有报道称过敏性哮喘患者气道的炎症和结构细胞产生过量的ROS，这与气道炎症、气道重塑和黏液高分泌密切相关[6]。在日常生活中很多因素都能诱发机体产生氧化应激，如吸烟、紫外线、有毒化学物质、饮酒或营养过剩等[7]，这些外界的氧化应激可能会刺激体内产生更多的ROS，加重哮喘症状。哮喘中的氧化/抗氧化失衡是炎症过程的重要机制之一。过量的ROS生产超过肺组织正常的抗氧化能力，从而损害肺组织不同成分如上皮功能，内皮细胞和气道平滑肌的生理功能。抗氧化剂的上调可能是必需的，以抵抗哮喘ROS的过量产生[8]。本研究结果显示，H2O2能显著促进OVA诱导的ROS的产生(P<0.01)。NADPH氧化酶是调节脂多糖诱导的肺炎、肺损伤、NF-κB活化及细胞因子产生的关键酶，例如，在肺炎情况下，NOX-2是控制ROS产生的主要亚型[9]。与ROS试验结果一致，H2O2也能显著促进OVA诱导的NOX-2的mRNA表达(P<0.01)。

有研究发现，哮喘患者气道上皮细胞SOD活性明显降低，SOD的减少有助于氧化应激[10]。常见的抗氧化物酶有SOD、GPx、CAT，其中SOD可保护过量ROS产生对肺组织的损伤[11]，而CAT的作用是分解过氧化氢[12]。本试验结果可见，H2O2能够显著抑制OVA诱导的SOD和CAT的活性(P<0.05)。ROS和NOX-2的过量产生和SOD和CAT活性的显著抑制导致肺组织氧化/抗氧化平衡严重失调。另外，氧化应激也可以启动和增强炎症，突出了氧化剂在哮喘的发病机制中的重要性[13-15]。本研究结果显示，OVA刺激后，哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13浓度显著升高(P<0.05)，明显加重OVA诱导的肺组织病理变化。以上试验结果表明用卵清蛋白和过氧化氢联合刺激可成功建立氧化应激特征性小鼠哮喘模型。

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