金花葵对小鼠急性炎症的抑制作用研究

付向晶，冯雪建，何 杨，张 继

(郑州大学药学院郑州大学国家药物安全性评价研究中心/郑州大学药物关键制备技术教育部重点实验室，河南郑州 450001)

炎症是许多疾病的病变基础，临床上有“十病九炎” 一说，多用非甾体类抗炎药和肾上腺皮质激素类等西药进行治疗，虽然效果较好，但二者会有诸多不良反应。而很多中药都有良好的抗炎效果，且副作用较少。金花葵(HibiscusmanihotL.)为一年生草本锦葵科秋葵属植物，又名菜芙蓉，虽未被《中国药典》收载，但一些研究证明其有多种良好的药理作用。金花葵在200多种秋葵植物中最具药用、食用及保健价值[1]。本文旨在探讨金花葵对小鼠急性炎症发生发展的抑制作用，为开发新的抗炎药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器及试剂 旋转蒸发器，河南智诚科技发展有限公司产品；电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司产品；酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品；全自动脱水机、组织包埋机、切片机、染色封片一体工作站、图像采集系统，德国徕卡有限公司产品；伊文思蓝，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品，批号：A1309044。

1.1.2 药物 金花葵，来自安国市百子康药行；复方醋酸地塞米松凝胶，江西吉安三力制药有限公司产品，批号：151006；醋酸地塞米松片，福州海王福药制药有限公司产品，批号：1702220。

1.1.3 实验动物 清洁级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18 g～22 g，购自河南省实验动物中心，合格证号：No.41003100004522。

1.2 方法

1.2.1 金花葵提取物的制备 将金花葵全株50℃干燥，粉碎，过50目筛，加适量石油醚脱脂6 h，称重，加40倍(m/V)量的800 mL/L乙醇，90 ℃水浴回流提取2 h，重复3次，合并提取液，旋转蒸发浓缩至含原生药1 g/mL，另配成每毫升含0.33 g和0.11 g原生药，分别标记为金花葵Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ溶液，置4℃冰箱备用。

1.2.2 金花葵对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 采用腹腔染料渗出法，参照文献[2]进行，取30只小鼠，将小鼠随机分成5组：动物模型组、地塞米松组、金花葵Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组。每组6只，雌雄各半。阳性药物选择醋酸地塞米松片，用量1.17 mg/kg。灌胃给药，灌胃体积0.2 mL，连续5 d，每天1次。动物模型组灌胃等体积生理盐水，试验期间小鼠自由采食。末次给药30 min后尾静脉注射20 g/L伊文思蓝生理盐水溶液0.01 mL/只，随即腹腔注射6 mL/L醋酸溶液0.2 mL/只，20 min后采用颈椎脱臼法处死小鼠。用5 mL生理盐水冲洗腹腔，将洗液2 500 r/min离心5 min，取上清，检测其在590 nm波长处吸光值(OD)，以此表示色素渗出率。

1.2.3 金花葵对二甲苯致小鼠耳片肿胀的抑制作用 实验动物分组同1.2.2。阳性药物选择复方醋酸地塞米松凝胶，用20 μL二甲苯均匀涂抹各组小鼠右耳内外两侧，左耳涂以同体积蒸馏水作为对照。30 min后，动物模型组右耳涂抹生理盐水，其余组在右耳均匀涂抹相应药物，各组左耳均涂抹同体积生理盐水。用药1 h后采用颈椎脱臼法处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，分别在左右耳相同部位用9 mm打孔器打下耳片，立即称重，以左右两耳片质量差值表示肿胀度，并与模型组比较计算耳片肿胀抑制率。具体操作方法参考文献[3]方法进行。

耳片肿胀率(%)=(右耳片质量-左耳片质量)/左耳片质量×100%

耳片肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀率-药物组平均肿胀率)/模型组平均肿胀率×100%

1.2.4 金花葵对角叉菜胶致小鼠足肿胀的抑制作用 动物分组和用药同1.2.2。将25 μL 10 g/L角叉菜胶注射于小鼠左足趾掌侧皮下，右侧注射等体积生理盐水作为对照。用药后2 h处死小鼠，沿踝关节下缘剪下左右两足，准确称量，记录数据，计算肿胀度及肿胀抑制率。具体操作方法参考文献[4]方法进行。

足趾肿胀率(%)=(左足趾厚度-右足趾厚度)/右足趾厚度×100%

足趾肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀率-药物组平均肿胀率)/模型组平均肿胀率×100%

将足趾沿正中矢状面切开，一部分组织称重，剪碎，加9倍量(m/V)生理盐水，室温浸泡2 h，5 000 r/min离心5 min，取上清液200 μL加入2 mL 0.5 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，50℃水浴20 min，吸取200 μL加于96孔板，用酶标仪检测波长278 nm处吸光度(OD)，用OD值代表炎症部位PGE2的含量。另一部分足用40 mL/L甲醛溶液固定HE染色，观察组织病理变化。

1.2.5 数据处理分析 用徕卡显微镜及图像处理系统对足趾切片进行观察及采集。应用SPSS软件对试验数据进行统计分析。

2 结果

2.1 金花葵对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

与动物模型组相比，地塞米松组和金花葵Ⅰ组在急性炎症发生时能极显著地抑制小鼠腹腔毛细血管透通性的增加(P<0.01)，金花葵Ⅱ组小鼠腹腔毛细血管透通性显著降低(P<0.05)，金花葵Ⅲ组小鼠腹腔毛细血管透通性虽有所下降，但差异不显著(P>0.05)，结果见表1。

2.2 金花葵对小鼠耳片肿胀的抑制作用

金花葵Ⅰ组、Ⅱ组虽较地塞米松组效果稍差，但与动物模型组相比，金花葵Ⅰ组、Ⅱ组均能显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀的发生(P<0.05)，金花葵Ⅲ组，耳片肿胀率无显著性差异(P>0.05)。且随金花葵溶液浓度的下降，其对耳片肿胀率抑制效果降低，呈剂量依赖性，结果见表2。

表1 金花葵对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

注：与动物模型组相比，“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

表2 金花葵对二甲苯致小鼠耳肿胀率的影响

注：与动物模型组相比，“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

2.3 金花葵对小鼠足肿胀的抑制作用

2.3.1 小鼠足趾肿胀的测定与分析 结果显示，与模型组比较，地塞米松组和金花葵Ⅰ组对小鼠足趾肿胀有极显著的抑制作用(P<0.01)；金花葵Ⅱ组有显著的抑制作用(P<0.05)；金花葵Ⅲ组对足趾肿胀无显著性抑制作用，该结果与其对足趾炎症部分PGE2渗出抑制结果相一致，结果见表3。

2.3.2 小鼠足趾肿胀病理学改变 和正常足趾相比，模型组小鼠足趾血管充血，皮下结缔组织及肌间水肿，且有大量中性粒细胞浸润，表现为急性化脓性炎症(图1B)。与动物模型组相比，地塞米松及金花葵Ⅰ组炎性细胞渗出明显变少，水肿减轻。金花葵Ⅱ组、Ⅲ组主要表现为炎性细胞渗出减少，水肿差异不明显，炎症程度明显有所缓解，结果见图1。

表3 金花葵提物对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀的影响

注：与动物模型组相比，“*”表示差异显著(P<0.05)，“**”表示差异极显著(P<0.01)。

Note:“* ” meansP<0.05，“**” meansP<0.01 vs model control group.

A.右侧正常足；B.动物模型组；C.地塞米松组；D.金花葵高剂量组；E.金花葵中剂量组；F.金花葵低剂量组

A．Normal foot; B.Animal model group; C.Dexamethasone group; D.Hibiscusmanihothigh dose group; E.Hibiscusmanihotmiddle dose group; F.Hibiscusmanihotlow dose group

图1各组小鼠足组织病理学切片HE染色结果(100×)

Fig.1 Histopathological section HE staining of paw in each group (100×)

3 讨论

炎症是具有血液循环的活体组织对损伤因子所产生的防御性反应，是平时人们所说的“发炎”。 炎症发生的中心环节是炎症部位的血管反应，其主要表现为炎症部位毛细血管充血扩张，通透性增加，进而炎症部位水肿和炎性细胞游出。本试验所选动物模型可以很好地模拟急性炎症临床发病过程与症状，且操作简便，被广泛用于抗炎药物的初筛和药效评价。金花葵含其主要有效成分由黄酮类、氨基酸及多糖等多种有效成分，具有解热抗炎[5-7]、镇痛[8-9]、抗肿瘤[10]、抗氧化[11]和调节血脂[12]等多种生物活性。可以药用和食用，根、茎、叶、花及果均可利用，有“植物界大熊猫”之称[11]。

本文利用3种动物模型探讨金花葵总提物对小鼠急性炎症的影响。结果表明，金花葵可以有效缓解急性炎症部位毛细血管的充血扩张及渗透性的增加，减少PGE2在炎症部位的释放。进而降低炎症的部位的水肿程度和炎性细胞的渗出量。对炎症的发生有明显的抑制作用，金花葵高剂量组与地塞米松效果相近，且呈剂量依赖性的抑制急性炎症的发生。

金花葵虽未被《中国药典》收载，但其成分复杂，含有较高的黄酮类化合物、不饱和脂肪酸和多糖类化合物，鉴于其具有多种药理活性和巨大潜在临床应用价值，因此有必要对其进行详细和全面的药效评价。

参考文献：

[1] 卢 丹,贾瑞波.中药金花葵的研究进展[J].中国药物评价,2015,32(2):90-92.

[2] 王梦远,郭 晓,刘晓婷,等.中药生物碱的提取及抗炎作用研究[J].动物医学进展,2017,38(4):80-83.

[3] 谷 捷,李 鑫,余黄合,等.二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型的建立[J].湖南中医药大学学报,2016,36(5):32-35.

[4] 孙 韬,王春霞,李东海,等.C57BL/6J小鼠急性足肿胀炎症模型的建立及指标评价[J].重庆医科大学学报,2016,49(2):175-178.

[5] Ambriz-Pérez D L,Bang W Y,Nair V,et al.Protective role of flavonoids and lipophilic compounds fromJatrophaplatyphyllaon the suppression of lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation in macrophage cells[J].J Agr Food Chem,2016,64(9):1899-1909.

[6] Qu L,Tian M,Zhu S,et al.Study on structure and property ofAbelmoschusmanihotfibers[J].J Natural Fibers,2016,13(2):215-226.

[7] Qiu Y,Ai P F,Song J J,et al.Total flavonoid extract fromAbelmoschusmanihot(L.) medic flowers attenuates d-galactose-induced oxidative stress in mouse liver through the Nrf2 pathway[J].J Med Food,2017,20(6):557-567.

[8] 史 宁,郭宏举,王 欢,等.金丝桃苷对急性炎症疼痛模型小鼠的抗炎镇痛作用研究[J].药物评价研究,2016,39(5):768-771.

[9] Xiao X,Wang X,Gui X,et al.Natural flavonoids as promising analgesic candidates:a systematic review[J].Chem Biodivers,2016,13(6):1427-1440.

[10] Waris R,Am E D P,Najib A.Radical scavenging activity of leaf extract of edible hibiscus (Abelmoschusmanihot(L.) Medik) using 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazil (DPPH)[J].Int J PharmTech Res,2016,9(6):343-347.

[11] 巫玲丽,穆祯强,张 利.金花葵多糖提取的工艺优化及抗氧化活性研究[J].南方农业学报,2017,48(1):109-113.

[12] 曹利华,苗明三.金花葵的现代研究与综合利用分析[J].中医学报,2016,31(12):1966-1968.