钩吻配伍减毒存效作用实验研究

李德森，王英豪，吴水生，刘清华，王河山

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

钩吻又名断肠草、山砒霜、野葛等，为马钱科胡蔓藤属植物胡蔓藤Gelsemium elegans Benth.的全株，因毒性巨大，民间一直以外用为主，主治湿疹、痈肿、体癣、跌打损伤、风湿痹痛、神经痛等［1］。钩吻毒性成分主要为吲哚类生物碱［2］，然吲哚类生物碱也有着独特的生物活性，现代药理实验也表明其对肿瘤、疼痛、炎症、免疫、皮肤病等的治疗发挥着重要作用［3-5］。但由于其治疗量和中毒量非常接近，安全指数较小，不乏中毒的临床报道［6］，大大限制了钩吻在临床上的应用。因而，如何降低钩吻的毒性，同时保持其药理活性，对于提高钩吻临床应用的安全性具有十分重要的意义。本研究旨从配伍减毒角度阐明钩吻减毒存效的有效方法。

1 材料

1.1 药品与试剂 钩吻碱甲对照品（由我院实验室自制，氢谱、碳谱、核磁共振和质谱数据与文献比较确认纯度大于99.9%）；钩吻（Gelsemium elegans）采自福建省龙岩市胡蔓藤种植基地；玉叶金花（Mussaenda pubescens）生药采自福建省福州市郊外；薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）、鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）购于福建中医药大学国医堂医院。均经福建中医药大学王河山老师鉴定。无水乙醇、醋酸钠、冰醋酸、氯仿、溴甲酚绿等均为分析纯。

1.2 实验仪器 紫外-可见分光光度计（UV-9100型，北京瑞利分析仪器公司）；电子分析天平（FA20004N型，北京赛多利斯天平有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52型，上海亚荣生化仪器厂）；数显恒温水浴锅（HH-S型，上海锦屏仪器仪表有限公司）；中草药粉碎机（FY135型，天津市泰斯特仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司）。

1.3 实验动物 健康昆明种6～8周龄小鼠，雌雄各半，体质量（20±2）g，由福建医科大学实验动物中心代购，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

2 方 法

2.1 药物制备

2.1.1 钩吻水煎液制备 取同一植株钩吻药材干品 10 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并滤液，浓缩并转移定容至10 mL，即得Ⅰ提取液，浓度为1 g／mL（以钩吻生药量计）。

2.1.2 钩吻醇提液制备 取同一植株钩吻药材干品10 g，置圆底烧瓶中，乙醇回流提取2次，每次30 min，合并上清液，回收乙醇，减压浓缩并转移定容至 10 mL，即得Ⅱ提取液，浓度为 1 g·mL-1（以钩吻生药量计）。

2.1.3 钩吻配伍玉叶金花液制备 取同一植株钩吻药材干品10 g、玉叶金花药材干品10 g，水煎煮2次，每次30 min，合并滤液，浓缩并转移定容至10 mL，即得Ⅲ提取液，浓度为 1 g·mL-1（以钩吻生药量计）。

2.1.4 钩吻配伍鱼腥草、薄荷液制备 取同一植株钩吻药材干品10 g、鱼腥草药材干品5 g、薄荷药材干品5 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并滤液，浓缩并转移定容至10 mL，即得Ⅳ提取液，浓度为1 g／mL（以钩吻生药量计）。

2.1.5 缺钩吻药材的中药液制备 称取玉叶金花药材干品 10 g，水煎煮 2次，每次 30 min，合并滤液，浓缩并转移定容至10 mL，即得Ⅴ提取液，浓度为1 g／mL（以玉叶金花生药量计）；称取鱼腥草药材干品5 g、薄荷药材干品 5 g，水煎煮2次，每次30 min，合并滤液，浓缩并转移定容至10 mL，即得Ⅵ提取液，浓度为1 g／mL（以鱼腥草、薄荷生药量计）。2.2 钩吻不同配伍方式总生物碱的含量测定

2.2.1 标准曲线建立 参照文献［7］中的方法，精密称取钩吻碱甲对照品约0.01 g，加入少量1 mol／L HCl溶解，用无水乙醇定容于10 mL容量瓶中，摇匀；分别精密吸取此对照品溶液 10、15、30、50、60 μL置于分液漏斗中，挥干乙醇，然后分别加入pH为4.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液5.0 mL，加入0.5 mL溴甲酚绿酸性染料溶液，摇匀；加入7.0 mL氯仿萃取，在40 min时终止反应，将氯仿层放出，在410 nm处测定吸光度，进行线性回归分析建模。

2.2.2 钩吻单煎液中总生物碱含量测定 分别精密移取Ⅰ、Ⅱ提取液各0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1项下的方法显色，测定吸光度值，计算总生物碱含量。

2.2.3 钩吻不同配伍液中总生物碱含量测定 分别精密移取Ⅲ、Ⅳ提取液各0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1项下的方法显色，测定吸光度值，计算总生物碱含量。

2.2.4 缺钩吻药材提取液的干扰吸收研究 分别精密移取Ⅴ、Ⅵ提取液各0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1项下的方法显色，测定吸光度值，以确定是否存在干扰吸收。

2.3 钩吻不同配伍方式的小鼠急性毒性研究

2.3.1 急性毒性预试验 目的在于先确认引起100%死亡率（Dm）的剂量。取小鼠16只，随机分成4 组，每组 4 只，禁食 24 h，自由饮水。按 4、2、1、0.5 g／kg的剂量分别给4组小鼠一次性灌胃给药钩吻水煎液。观察并记录小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况。

2.3.2 急性毒性试验 将24只小鼠随机分成3组：钩吻组（给药剂量为预试Dm剂量，下同）、钩吻配玉叶金花组、钩吻配鱼腥草、薄荷组，每组8只。用苦味酸标记，试验前禁食不禁水24 h，然后将各组小鼠按照2.3.1中计算所得的剂量进行一次性灌胃给药。观察并记录小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况。

2.4 钩吻配伍玉叶金花的减毒存效研究

2.4.1 钩吻不同配比玉叶金花对总生物碱含量的影响 参照2.1.3项“钩吻配伍玉叶金花液制备”分别制备钩吻∶玉叶金花 1∶2、1∶3 提取液，分别得浓度为1 g／mL的Ⅶ、Ⅷ水提液（均以钩吻生药量计）。总生物碱含量测定：分别精密移取Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ提取液0.2 mL置于分液漏斗中，按2.2.1项下的方法显色，测定吸光度，计算总生物碱含量。

2.4.2 钩吻不同配比玉叶金花的急性毒性实验将32只小鼠随机分成4组：钩吻组、钩吻配玉叶金花 1∶1 组（配伍Ⅰ组）、钩吻配玉叶金花 1∶2 组（配伍Ⅱ组）、钩吻配玉叶金花1∶3组（配伍Ⅲ组），每组8只。用苦味酸标记，试验前禁食不禁水24 h，然后将各组小鼠按0.875 g／kg给予Ⅲ、Ⅶ、Ⅷ水提液进行一次性灌胃。观察记录小鼠24 h内的中毒症状和死亡情况。

2.4.3 钩吻不同配比玉叶金花的镇痛实验 将20只小鼠随机分成4组：生理盐水组、钩吻组、配伍Ⅱ组、配伍Ⅲ组，每组8只。用苦味酸标记，钩吻组、钩吻配玉叶金花组分别按0.5 g／kg灌胃给药，1 h后，每只小鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.1 mL／10 g。观察并记录注射醋酸溶液后15 min内小鼠因疼痛扭体的次数。

图1 钩吻碱甲标准曲线图

3 结 果

3.1 钩吻不同配伍方式总生物碱的含量测定

3.1.1 标准曲线绘制 以钩吻碱甲对照品含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程：Y＝0.0233X＋0.2228（r＝0.999 0）。 结果表明当钩吻碱甲对照品含量在10～60 μg，吸光度与对照品含量呈现良好的线性关系。

3.1.2 不同配伍方式总生物碱的含量测定 钩吻单煎液、不同配伍液中总生物碱的含量测定结果显示：钩吻配伍鱼腥草、薄荷总生物碱含量较醇提液有所降低；钩吻配伍玉叶金花后总生物碱含量较钩吻水煎液、醇提液均明显降低，而缺钩吻药材的提取液几乎没吸收。可见，钩吻不同配伍方式均可在一定程度上降低其总生物碱含量，尤其是钩吻配伍玉叶金花。结果见图2。

图2 不同配伍方式钩吻总生物碱含量测定

3.2 钩吻不同配伍方式的小鼠急性毒性研究

3.2.1 急性毒性预实验 急性毒性预试验结果表明：钩吻不同剂量给药后，小鼠出现痉挛、惊厥、跳跃，最后呼吸衰竭而死，死亡时间均在给药后0.5 h内。当钩吻剂量≥1 g／kg时，小鼠死亡率为100%，故确定钩吻的Dm剂量为1 g／kg，进行下一步急性毒性实验。

3.2.2 急性毒性实验 钩吻不同配伍的急性毒性试验结果表明：小鼠给予钩吻1 g／kg时，全部死亡，但钩吻配伍玉叶金花、钩吻配伍鱼腥草、薄荷后，小鼠死亡率均下降至87.5%，且死亡时间亦明显延长，与钩吻组比较有显著性差异（P＜0.05）。综合3.1.2项下研究结果，选用钩吻配伍玉叶金花进一步考察其减毒存效的研究。

表1 钩吻的急性毒性预试验

表2 钩吻不同配伍的急性毒性试验（x±s）

3.3 钩吻配伍玉叶金花的减毒存效研究

3.3.1 不同配比对总生物碱的影响 钩吻不同配比的总生物碱含量测定结果表明：钩吻、玉叶金花合用，随着配比的增加，总生物碱含量降低，见图3。

图3 不同配比对钩吻总生物碱含量的影响

3.3.2 不同配比的急性毒性试验 钩吻不同配比的急性毒性结果表明：钩吻、玉叶金花合用，随着配比的增加，小鼠死亡率大幅降低，综合3.3.1项结果可知，钩吻配伍玉叶金花后可达到“减毒”作用。

表3 钩吻不同配比的急性毒性试验

3.3.3 不同配比的镇痛试验 钩吻与玉叶金花不同配比组的镇痛结果表明：给药组与生理盐水组比较，扭体次数显著降低（P＜0.01或＜0.05），且钩吻配伍玉叶金花（1∶2）组与钩吻组小鼠醋酸扭体次数差异无显著性（P＞0.05），表明钩吻配伍玉叶金花后仍保留镇痛作用，但镇痛效果随玉叶金花比例增加而减弱。

图4 钩吻与玉叶金花不同配比组小鼠醋酸扭体次数（x±s）

4 结 论

4.1 钩吻分别配伍玉叶金花、薄荷与鱼腥草后均可在一定程度上降低钩吻总生物碱含量，降低小鼠死亡率，延长小鼠死亡时间，其中钩吻配伍玉叶金花减毒作用尤为明显。

4.2 钩吻配比不同比例玉叶金花（1∶1、1∶2、1∶3）后，随着配比的增加，总生物碱含量降低，小鼠死亡率亦大幅降低，达到“配伍减毒”的效果，且保留明显的镇痛作用，达到“存效”的效果。

4.3 中药配伍减毒增（存）效是中医药学的特色和优势之一。钩吻为剧毒植物，配伍玉叶金花后能减缓其毒性，保留其镇痛药效，但配伍解毒机制有待进一步深入探讨。

参考文献：

［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海：上海科学技术出版社，1998.

［2］ WANG Y H，WU S S，CHEN Z C，et al.Inhibitory effects of cytochrome P450 enzymes CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1 and CYP3A4 by extracts and alkaloids of Gelsemium elegans roots ［J］.Journal of Ethnopharmacology，2015（166）：66-73.

［3］ XU Y，QIU H Q，LIU H，et al.Effects of koumine，an alkaloid of Gelsemium elegans Benth.，on inflammatory and neuropathic pain models and possible mechanism with allopregnanolone ［J］.Phar-macology，Biochemistry and Behavior，2012，101（3）：504-514.

［4］ XU Y K，LIAO S G，NA Z，et al.Gelsemium alkaloids，immunosuppressive agents from Gelsemium elegans［J］.Fitoterapia，2012，83（6）：1120-1124.

［5］ 卢伊.钩吻总生物碱提取物抗慢性粒细胞白血病作用及其机制研究［D］.福州：福建中医药大学，2014.

［6］ RUJJANAWATE C，KANJANAPOTHI D，PANTHONG A.Pharmacological effect and toxicity of alkaloids from Gelsemium elegans Benth［J］.Journal of Ethnopharmacology，2003，89（1）：91-95.

［7］ 王河山，吴水生，王英豪，等.闽产钩吻根总生物碱的分离纯化研究［J］.海峡药学，2015，27（7）：46-49.