松郁安神方对异相睡眠剥夺大鼠海马CREB表达的影响

曾雪爱 ，周春权 ，王秀峰 ，张一帆 ，黄俊山 （1.福建省中医药研究院，福建 福州 350003；2.福建省中医睡眠医学重点实验室，福建 福州 350003）

睡眠是机体复原、整合和巩固记忆的重要环节，是维持生命所必须的过程，根据睡眠过程中脑电图、眼球运动情况，睡眠可分为快速眼球运动（rapid eye movement，REM）和非快速眼球运动（non rapideye movement，NREM）两个时相。其中 REM 睡眠亦称异相睡眠（paradoxical sleep），它对于保证学习、记忆和情感等大脑高级功能正常具有非常重要的作用［1］。随着生活节奏的加快和社会竞争的增加，睡眠障碍或睡眠相关疾病的发生率逐年增加，越来越多的人处于慢性睡眠剥夺状态。长期睡眠不足或异相睡眠剥夺（paradoxical sleep deprivation，PSD）严重影响人们的生活质量、身心健康和学习记忆。松郁安神方是黄俊山教授临床上治疗失眠的经验效方，临床上用于治疗失眠疗效显著。前期实验已证实该方能改善REM睡眠剥夺所致的大鼠学习记忆能力下降［2］，本实验进一步通过检测大鼠海马学习记忆的关键蛋白——cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的表达和变化，探讨松郁安神方改善PSD大鼠学习记忆能力的作用机制。

1 材料

1.1 动物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清洁级，体质量（200±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。动物置于实验环境中饲养3 d，给予充足食物和水。实验前将大鼠随机分为4组：对照组、PSD模型组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组5只。

1.2 主要药品与试剂 RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq（大连TaKaRa公司）；细胞裂解液、PMSF（碧云天生物技术有限公司）；蛋白 Marker（美国 Thermo 公司）；一抗：CREB及 p-CREB（美国 Cell Signaling Technology公司）；GAPDH（美国 Cell Signaling Technology公司）；二抗：辣根过氧化物酶标记二抗（美国 SAB公司）；显影液（美国Thermo公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。中药松郁安神方由福建省中医药研究院提供。

1.3 主要仪器 睡眠剥夺装置（中国医学科学院药物研究所）；微量紫外分光光度计（美国Thermo公司）；7 500 fast型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；蛋白电泳和电转仪（美国Bio-Rad公司）；Alpha多色荧光、化学发光凝胶成像系统（美国ProteinSimple公司）。

2 方 法

2.1 PSD模型建立 采用改良多平台睡眠剥夺法建立模型［3］。每次取8只大鼠放入睡眠剥夺装置内，内有9个小平台，平台直径6.5 cm，平台周围注满水，平台高出水面约1.0 cm。当大鼠进入异相睡眠时，由于全身肌肉张力降低，出现垂头触水而觉醒，使动物不能进入异相睡眠，连续睡眠剥夺96 h。对照组采用与睡眠剥夺组一样的装置，只是把大鼠放在直径为12.0 cm的大平台上，在大平台上的动物能够进入异相睡眠，使其所处环境与其它组完全一致。2.2 给药方法 睡眠剥夺第1天开始进行灌胃给药。松郁安神方由甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，丹参 15 g，酸枣仁 15 g，首乌藤 30 g，珍珠母30 g，生龙骨30 g，合欢皮 15 g组成，药材加 10倍量的水浸泡30 min，珍珠母和生龙骨先煎30 min后，加入其余中药，先武火煮沸，再文火煮30 min，过滤，残渣加水煎煮，重复2遍，合并滤液，浓缩至所需浓度。中药高剂量组、中药低剂量组分别按34 g／kg、17 g／kg体质量灌胃给药，对照组和PSD模型组均给予等体积蒸馏水，每天1次，共7 d。于第7天灌胃2 h后取材，在冰面上迅速分离海马组织，-80℃冰箱保存。

2.3 实时荧光定量PCR检测 总RNA提取参照试剂盒说明书进行。提取的总RNA纯度及完整性检测后，选用天根Quant cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。在进行RT-PCR实验前，用普通PCR检验引物的特异性，PCR扩增产物用1.7%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq（2×） 10 μL，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上下 游 引 物分别 为 1 μL，cDNA 模 板 7.5 μL，加DEPC水补至20 μL。PCR的反应条件为：95℃预变性 30 s，95℃变性 3 s，60℃延伸 30 s，40 个循环。

2.4 蛋白印迹法检测 取海马研磨，使组织细碎，加入裂解液，置于冰上裂解，匀浆液离心，采用微量紫外分光光度计测定组织总蛋白含量。总蛋白按1∶1加入2×上样缓冲液，混匀，变性处理后进行蛋白印迹法检测，其步骤大致如下：经过灌胶、加样、电泳、转膜后，将膜放入5%脱脂奶粉封闭液置室温摇床上封闭 2 h，加一抗（CREB，兔抗，1∶500；p-CREB，兔抗，1∶500；GAPDH，兔抗，1∶1 000）于 4℃孵育过夜。然后加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的二抗（羊抗兔 1∶5 000），二抗室温摇床上孵育 1 h，最后将膜正面朝上放置在显影板上，曝光显影。用AlphaView SA软件分析光密度，根据光密度对蛋白条带进行分析，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白与内参光密度比值。将对照组的光密度比值设定为1，其余各组与对照组的比值作为最后结果进行统计。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 松郁安神方对PSD大鼠海马CREB mRNA表达的影响 实时荧光定量PCR结果显示：连续睡眠剥夺96 h后，大鼠海马CREB mRNA表达明显降低，相对表达量为（0.63±0.10），与对照组比较有统计学意义（P＜0.01）；不同剂量松郁安神方干预后CREB mRNA表达明显升高，并呈明显的剂量效应，中药高剂量组相对表达量为（0.86±0.09），与模型组比较有统计意义（P＜0.01），中药低剂量组相对表达量为（0.75±0.08），差异也有统计学意义（P＜0.05）。 见图 1。3.2 松郁安神方对PSD大鼠海马CREB蛋白表达的影响 蛋白印迹法结果显示：连续睡眠剥夺96 h后，大鼠海马磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表达降低，相对表达量为（0.63±0.03），与对照组比较，有统计学意义（P＜0.01）；中药高、低剂量组干预后p-CREB表达明显升高，中药高剂量组相对表达量为（0.91±0.03），中药低剂量组相对表达量为（0.78±0.09），与模型组比较，均有统计学意义（P＜0.01）。见图2。

图1 4组PSD大鼠海马CREB mRNA表达量比较

图2 4组PSD大鼠海马p-CREB蛋白表达量比较

4 讨 论

在异相睡眠期，除眼肌和中耳肌外，其它肌肉尤其是颈后肌和四肢肌肉的张力极度下降，不能维持某种姿势［3］，改良多平台睡眠剥夺法是根据这一原理设计。此外，为了避免水环境对动物造成一定的应激反应，本实验采用大平台进行对照。大平台的直径允许大鼠进入异相睡眠，其他环境均与小平台相同。目前该方法是研究睡眠剥夺较常用且成熟的动物模型建立方案。

学习记忆与睡眠是相互影响的过程，学习记忆能影响睡眠的结构和时间，睡眠也可对觉醒时所获信息进行加工、整理并巩固成长时记忆，其中，异相睡眠与学习记忆关系较大。有研究报道：异相睡眠剥夺对大鼠的学习记忆能力存在一定的损害，其学习和记忆的获得与巩固过程下降［4］；异相期睡眠剥夺可引起大鼠空间参考记忆能力低下［5］。

CREB是一种关键的核转录因子，在各系统中均发挥着重要的作用，能调节神经可塑性相关基因的表达［6］。很多与睡眠相关的神经递质和调质可影响脑内cAMP的含量［7］。当神经递质与细胞膜上的特异受体结合后，激活腺苷酸环化酶，水解生成第二信使cAMP，cAMP进一步激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），即激活cAMP-PKA信号通路，CREB在神经系统中通常作为许多信号通路的终止与交汇点，其调控的上下游信号分子及其靶基因和CREB一起参与了神经细胞存活、再生、分化等过程，与突触的可塑性和学习记忆等正常生理活动密切相关［6，8］。 研究表明：睡眠剥夺阻碍海马 cAMPPKA信号通路，可扰乱认知过程［9］。对啮齿动物的研究也表明：REM睡眠剥夺能降低海马磷酸化CREB （P-CREB）水平［10］。可见海马中磷酸化 CREB水平与学习记忆关系密切。

松郁安神方既能改善大鼠REM睡眠剥夺大鼠的学习记忆能力［2］，又能够镇静安神，增加睡眠时间和深度，从而改善记忆。本实验结果显示：REM睡眠剥夺96 h后，大鼠海马CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表达均降低，这与之前的研究报道一致。松郁安神方干预后，能明显升高海马CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表达，提示松郁安神方改善大鼠学习记忆能力可能通过调节CREB而发挥作用。但该方是否进一步调控CREB相关的信号通路，还有待于进一步的研究。

参考文献：

［1］ 尹贞云，赵忠新.镇静催眠作用药物对失眠患者睡眠结构的影响［J］.中华神经科杂志，2010，43（1）：69-71.

［2］ 曾雪爱，黄俊山，王雅丽.松郁安神方对REM睡眠剥夺大鼠认知功能及神经递质的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2012，18（4）：392-393，397.

［3］ 黄建欧，赵忠新.大鼠睡眠剥夺方法的研究进展［J］.中华神经医学杂志，2004，3（3）：229-230.

［4］ 叶晨静，赵忠新.快速眼球运动睡眠剥夺对大鼠学习、记忆能力及其海马组织脑源性神经营养因子表达的影响［J］.第二军医大学学报，2007，28（1）：82-86.

［5］ 张微胜，侯一平，王德贵，等.异相睡眠剥夺对大鼠空间学习记忆的影响［J］.中国行为医学科学.2004，13（5）：496-498.

［6］ HEYWARD P．Presenilin dysfunction leads to memory and plasticit defects ［J］．Lancet Neurol，2004，3（6）：327．

［7］ 朱国庆，张惠秀，王敏，等.中枢应用外源性cAMP和ATP对大鼠睡眠的影响［J］. 中国应用生理学杂志，1993，9（2）：189-190.

［8］ LONZE B E，GINTY D D.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system ［J］.Neuron，2002，35（4）：605-623.

［9］ LUO J，PHAN T X，YANG Y，et al.Increases in cAMP，MAPK activity，and CREB phosphorylation during REM sleep：implications for REM sleep and memory consolidation ［J］.J Neurosci，2013，33（15）：6460-6468.

［10］ ALHAIDER I A，ALEISA A M，TRAN T T，et al.Sleep deprivation prevents stimulation-induced increases of levels of P-CREB and BDNF：protection by caffeine ［J］.Molecular and Cellular Neuroscience，2011，46（4）：742-751.