聚山梨酯80修饰的天麻素脂质体制备研究*

穆 珺，王春柳，张 红，刘 洋，马虎强，李 晔△

1.陕西中医药大学(咸阳 712046)，2.陕西省中医药研究院(西安 710003)

天麻素(gastrodin)又称天麻苷，是天麻中的主要活性成分。《本草汇言》认为，天麻“主头风、头痛、癫痫强痉以及一切中风”，主要用以治疗癫痫、眩晕症以及血管性疾病[1]。其中，付金花等[2]将天麻素与丹红注射液联用于糖尿病联合脑梗死患者治疗，结果表明，与单用丹红注射液相比，两者联用能明显减少糖尿病合并脑梗死患者神经功能的损伤；车启富等[3]研究了天麻养肝降脂汤对于原发性高血压的临床效果，结果表明，西药基础上联用天麻养肝降脂汤安全且疗效显著。目前，含有天麻的方剂麻芎舒痛方[4]、天麻钩藤饮[5]及头痛宁[6]、天麻眩晕宁颗粒[7]等中成药在临床上广泛应用于眩晕、偏头痛等疾病的治疗，不良反应小，毒副作用少。

血脑屏障作为天然的脑组织屏障系统，在维持中枢神经系统稳态的同时也限制了许多药物脑靶向透过血脑屏障发挥治疗作用。脂质体是磷脂分散在水中形成的类球状双分子层囊泡，研究表明，脂质体可通过多种途径促进药物入脑，如被动转运、与脑血管内皮细胞膜发生膜融合或内吞[8]。聚山梨酯80(Polysorbate-80, P-80)的毒性小且修饰后可经受体介导的内吞作用跨血脑屏障，增加药物入脑量[9]。

本文采用薄膜-超声法制备P-80修饰的天麻素脂质体，通过星点设计-效应面法对脂质体处方进行优化，并对脂质体进行表征，为体内研究奠定基础。

材料与方法

1 材 料

1.1 仪 器:1260型LC(Agilent)；Sartorius BP211D 型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯天平有限公司)；KQ-250DE超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)；R-3旋转蒸发仪(瑞士布琦公司)；HJ-6磁力搅拌器(常州国华电器有限公司)；TGL-18台式高速冷冻离心机(湖南长沙英泰仪器有限公司)；超声波细胞粉碎机(南京舜玛仪器设备有限公司)；ZEN3600型激光粒度仪(英国Marlvern公司)。

1.2 药品与试剂:天麻素对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110807-201306，供含量测定用，纯度98%)；天麻素原料药(纯度>98%)；卵磷脂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度>98%)；胆固醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度>95%)；P-80(国药集团化学试剂有限公司)；氯仿为分析级，水为超纯水(法国，Millipore超纯水系统)，甲醇为色谱级。

2 方 法

2.1 P-80修饰脂质体的制备:采用薄膜-超声法制备P-80修饰的天麻素脂质体，称取处方量的卵磷脂、胆固醇于梨形瓶中，并依据参考文献及单因素实验结果按照P-80:脂质=1:10 (w/w)加入P-80，再加入适量氯仿超声溶解后，45℃减压蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成均匀的脂质膜，加入天麻素水溶液后手摇使脂质膜溶解，超声30 min，于超声波细胞粉碎机30%功率超声2 min，得到澄清透明的淡蓝色溶液[10]。

2.2 脂质体包封率与载药量测定

2.2.1 色谱条件：色谱柱为Kromasil-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇-水(7:93)，检测波长220.0 nm，柱温30℃，流量1.0 ml/min，进样量为10μl。

2.2.2 标准曲线绘制:精密称取天麻素对照品5.20 mg，用甲醇溶解并定容，得浓度为0.52 mg/ml对照品储备液。精密吸取适量储备液，稀释成浓度分别20.80、26.00、52.00、104.00、208.00μg/ml的对照品溶液，按照2.2.1条件测定并记录峰面积。以对照品溶液浓度对峰面积进行线性回归，绘制标准曲线。

2.2.3 精密度考察:取浓度分别为26.00、52.00、104.00 μg/ml的天麻素对照品溶液，按照2.2.1项下条件测定，分别连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。

2.2.4 稳定性考察:取浓度为52.00 μg/ml的天麻素对照品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h，按照2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD。

2.2.5 包封率与载药量测定:取2 ml制备好的脂质体溶液于离心管中，4℃、1.0×104r/min，离心60 min，精密移取上清液100 μl，加水定容至2 ml。按照2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算包封率和载药量。

2.3 优化设计：选取脂质浓度(X1)、磷脂与胆固醇比例(X2)、脂质与药物比例(X3)为考察因素，以包封率(Y1)与载药量(Y2)为评价指标设计实验。X1的3水平分别为6、11、16 mg/ml，X2为2:1、5:1、8:1，X3为5:1、10:1、15:1。

2.4 脂质体形态：取制备的P-80修饰的脂质体溶液适量，蒸馏水稀释数倍后滴至铜网上，15 min后用3%磷钨酸负染，透射电镜观察脂质体形态。

2.5 粒径及表面电位的测定：分别取P-80修饰的纳米粒溶液和未修饰的纳米粒溶液适量，经蒸馏水稀释后，测定粒径及Zeta电位。

结 果

1 天麻素含量测定方法考察:

以对照品溶液浓度对峰面积进行线性回归，得方程Y=28293X+14.326(r=0.9995)，表明天麻素在20.80～208.00 μg/ml线性关系良好；精密度考察结果显示3种不同浓度天麻素对照品溶液RSD分别为0.10%，0.12%和0.09%，表明精密度良好；稳定性考察结果显示RSD 0.21%，表明对照品溶液在24 h内稳定性良好。

2 优化设计

2.1 实验设计结果:依据3因素3水平实验设计进行实验，并以包封率(Y1)与载药量(Y2)为评价指标，结果见表1。

表1 Box-Behnken实验设计及结果

2.2 模型拟合:采用Design Expert 8.06实验设计软件分别对指标Y1和Y2与各因素间的关系进行拟合。通过对比线性与二项式拟合，结果显示二项式拟合效果最佳，二项式方程。对二项式回归方程进行方差分析，结果见表2和表3。

Y1=32.49+1.43x1-0.29x2+0.44x3-1.43x1x2+0.39x1x3-0.16x2x3+1.15x12-1.20x22+0.82x32(r=0.9455，P=0.0107)

Y2=3.25+0.15x1-0.025x2-2.16x3-0.14x1x2-0.050x1x3-0.015x2x3+0.12x12-0.12x22+1.16x32(r=0.9996，P﹤0.0001)。

由表2、3结果可得，脂质体包封率Y1受X1、X1X2、X12、X22的影响均有显著性，载药量Y2受X1、X3、X1X2、X12、X22、X32的影响显著；脂质体包封率与载药量的模型均有显著性，而失拟性检验均无显著性，表明建立的二项式模型拟合度良好，可较好预测响应值。

表2 二项式回归模型显著性检验(包封率)

表3 二项式回归模型显著性检验(载药量)

2.3 工艺优化：应用Design Expert 8.06实验设计软件绘制各因素对响应值的三维效应面。天麻素脂质体的包封率Y1受X1的影响显著，在一定范围内随着脂质浓度的增加，包封率增加；天麻素脂质体的载药量Y2受X1、X3的影响显著，随着脂质浓度的增加，载药量增加；随着脂质与药物比例的增加，载药量降低。根据效应面选出各因素的最佳取值范围，确定出最优处方为：x1=15.95mg/ml，x2=3.09:1，x3=5:1，预测包封率Y1=35.52%，载药量Y2=6.93%。

2.4 工艺验证：根据优选的最佳工艺参数条件制备3批样品，与模型预测值进行比较。软件对最优工艺条件下，Y1与Y2的预测值分别为35.52%与6.93%，Y1与Y2的实测值分别为(35.17±0.25)%与(7.03±0.05)%，各考察指标实测值与预测值差异较小，偏差均小于5%，表明所建立的模型方程预测性较好。

3 脂质体表征：从图1可得，P-80修饰前后脂质体外观均呈类球形。普通脂质体与P-80修饰后的脂质体的平均粒径和Zeta电位结果见图2、3。结果可得：与普通脂质体相比，修饰后的脂质体粒径及多分散指数均较小，电位绝对值稍有增大，整个体系分布均匀且稳定性相对较好。

图1 普通脂质体(A)与聚山梨酯 80修饰的天麻素脂质体(B)透射电镜图

图2 普通脂质体(A)和P-80修饰(B)脂质体粒径分布图

图3 普通脂质体(A)和P-80修饰(B)脂质体电位分布图

图4 各因素与响应值的三维图

讨 论

星点设计是基于析因设计，加上极值点及中心点而形成的试验设计，具有实验次数少、同时具有线性与非线性拟合的特点，其数据结果可采用结合数学与统计学方法的效应面法进行优化[11-12]。与覃引等[12]，采用正交法优化天麻素脂质体制备工艺相比，星点设计-效应面法的因素均是连续值，最优工艺可以是因素最大值与最小值之间的任意值，而正交试验则只能选择因素的水平点，因而星点设计-效应面法的优化结果精度更高，预测性更好；同时星点设计-效应面法还可考察各因素对响应值、各因素间的交互作用，可较好的描述因素与响应值间的关系。有文献报道[13]，理想的可到达脑部载体的粒径一般应≤100 nm；又有文献证明[14]，分别给药粒径为70、170、220和345 nm的P-80修饰的纳米粒，粒径为70 nm时其脑内药物浓度最高，表明粒径对药物递送入脑效率有一定的影响。与覃引[12]，等采用薄膜-蒸发法制备的天麻素脂质体粒径为327 nm相比，本文制备的脂质体粒径显著减小，可能更易于通过血脑屏障，药物到达脑部发挥治疗作用。与黄静[15]，等制备的天麻素脂质体电位为(-1.36 ±0.57)mv相比，本文脂质体的电位为(-14.1±0.83)mv，电位的绝对值有显著提高，从而使脂质体具有较好的稳定性。

随着脑胶质瘤、抑郁、阿尔兹海默症等中枢神经系统疾病发病率逐年递增，越来越多的研究者专注于提高药物脑靶向的给药系统研究。非离子表面活性剂，如吐温-80、泊洛沙姆等修饰于载体表面，可通过与血液中的载脂蛋白B(Apo B)或E相互吸附，通过低密度脂蛋白(LDL)受体介导的内吞作用透过血脑屏障、并抑制P-糖蛋白将已跨过血脑屏障的载体外排，提高药物到达脑内靶部位浓度，达到减毒增效的目的[16]。本文通过薄膜-超声法制备P-80修饰的天麻素脂质体，采用星点设计-效应面法优化制备工艺，为其后期体内研究奠定基础。

[1] 那丽莎,栗昭生,郑 帅,等.浅析天麻的鉴定, 药理学作用及临床应用[J].中医临床研究, 2017, 9(20): 129-130.

[2] 付金花,王丽娟,曹洪民.天麻素联合丹红注射液在糖尿病合并脑梗死的疗效观察[J]. 陕西中医,2017, 38(9): 1168-1169.

[3] 车启富,何丽杰,李维民.天麻养肝降脂汤治疗原发性高血压的临床疗效观察[J].陕西中医, 2016，37(5): 523-525.

[4] 张金培,杨 屹,靳 艳.麻芎舒痛方治疗偏头痛的临床效果及对血清 5-HT, NF-κB和炎症因子水平的影响[J].昆明医科大学学报, 2017,22 (8): 40-43.

[5] 李 桓,李树岗.加味天麻钩藤饮治疗偏头痛 40 例疗效观察[J].中国中医药科技, 2007, 14(1): 7-7.

[6] 马 娟,刘 宁,陈 军, 等.头痛宁胶囊联合氟桂利嗪胶囊治疗偏头痛的临床疗效及机理研究[J].中成药,2013，36(4): 677-680.

[7] 董 慧. 天麻眩晕宁颗粒原材料中钩藤、泽泻、半夏的质量标准研究[J].内蒙古中医药,2011, 30(18): 854-857.

[8] 黄向华,徐维平,陆 杨,等.脑靶向脂质体的研究进展[J].中国药业,2012, 21(20): 15-17.

[9] 田 宇,沈 雁,涂家生.非离子表面活性剂在脑靶向传递系统中的研究进展[J].中国新药杂志, 2015, 24(2): 166-170.

[10] Huang Y B, Tsai M J, Wu P C,etal. Elastic liposomes as carriers for oral delivery and the brain distribution of (+)-catechin[J]. Journal of drug targeting, 2011, 19(8): 709-718.

[11] 张雪峰,杨 轲,欧 燕,等.星点设计-效应面法优化天山雪莲提取物磷脂复合物制备工艺[J] . 中草药, 2014, 45(16): 2326-2332.

[12] 覃 引.天麻素纳米脂质体和纳米微球的制备研究[D].贵阳：贵州大学,2008.

[13] Olivier J C. Drug transport to brain with targeted nanoparticles[J].NeuroRx,2005,2(1): 108-119.

[14] Gao K, Jiang X. Influence of particle size on transport of methotrexate acrossblood brain barrier by polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylatenanoparticles[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2006, 310(1): 213-219.

[15] 黄 静,何 文,李秀芳,等.天麻素纳米脂质体的研制及其脑靶向性的初步研究[J].广东药学院学报, 2011, 27(4): 345-350.

[16] Gao H. Progress and perspectives on targeting nanoparticles for brain drug delivery[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2016, 6(4): 268-286.

(收稿：2017-12-26)