低渗温热灌注对小鼠肝癌腹水瘤的抑制作用

陈 强，刘师宇，杜宁芳，李思佳，顾美晨，杜海英*

(吉林大学公共卫生学院 1.预防医学实验教学中心;2.卫生毒理学教研室，吉林 长春130021)

腹腔低渗热灌注化疗已被广泛尝试用于预防一些恶性肿瘤导致的腹腔种植转移[1]。临床针对胃癌、结直肠癌术中的处理研究较多，包括广泛的多次腹腔灌洗、腹腔内温热灌注化疗、持续高温腹腔灌洗等[2-4]。我们采用小鼠肝癌腹水瘤腹腔接种模型，观察不同温度的某低渗液及与化疗药物联合应用，对肝癌腹水瘤的生长抑制作用及其可能产生的副作用。探讨能够结合热化疗药物达到最佳作用的灌注液介质，为腹腔内温热低渗化疗应用于临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物昆明小鼠80只，SPF级，健康成年雄性，体重22-25 g，辽宁长生生物技术股份有限公司，适应性饲养5天，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2实验试剂低渗溶液(长春呈实健康实业有限公司)，注射用顺铂(DDP，10 mg/支，齐鲁制药厂)。

1.3方法

1.3.1H22细胞复苏腹腔传代 小鼠腹水型肝癌细胞H22，由本实验室提供。取冻存的H22细胞，于37℃恒温水浴中迅速解冻，加入适量生理盐水混匀离心1000 rpm 5 min；洗涤三次；台盼兰染色进行活细胞计数，制成单细胞悬液1×107/ml，每只小鼠腹腔内注射 0.1 ml(1×106/只)进行第一次腹腔接种。

1.3.2小鼠肝癌腹水模型的建立 腹水形成后，脱臼处死小鼠，浸泡于75%乙醇1-2 min后，置于超净工作台。抽取腹水，加入生理盐水悬浮稀释，1 000 rpm 5 min离心洗涤三次，稀释细胞浓度为1×107/ml，每只小鼠腹腔注射 0.1 ml(1×106/只)建立肝癌腹水模型。

1.3.3动物分组与处理 小鼠随机分为4组，每组16只，腹腔接种瘤细胞24小时后：①对照组：腹腔注射37℃生理盐水；②低渗组：腹腔注射37℃低渗液；③低渗热灌注组A：腹腔注射43℃低渗液；④低渗热灌注组B：腹腔注射45℃低渗液；⑤低渗热灌注化疗组：腹腔注射43℃低渗液+顺铂(DDP)；注药液量为2 ml/只，化疗药DDP的浓度为0.05 mg/ ml(每只鼠给药量为2.5 mg/kg)。接种后第1、8天各灌注1次，共2次。

1.3.4观察与检测指标 ①接种后，每3日测鼠重、测量腹围，进行腹腔穿刺观察腹水产生时间；小鼠死亡时计腹水量；②小鼠出现腹水时每只取0.5 ml，按白细胞计数计瘤细胞总数；用台盼蓝染色计瘤细胞存活率；③移植瘤生长潜伏期、移植率、荷瘤生存期和生命延长率；生命延长率(%)=(实验组平均生存天数/对照组平均生存天数-1)×100%。④解剖观察胸、腹腔内脏器官的病理变化。

2 结果

2.1荷瘤模型观察

腹腔内注射瘤细胞 1×106/只建立荷瘤模型，对照组明显腹水形成潜伏期为7.5±0.5 天，移植率达100%，腹部增大膨隆明显，状如蛙腹；低渗组和低渗热灌注组腹部增大较小；而低渗热化疗组腹部增大不明显，死亡后未见腹水。

2.2大体观察

给药后两周内，对照组未出现死亡。低渗液37℃灌注后，对腹水瘤的产生有较好的抑制作用，能够明显延长实验动物的生存期，大体观察发现该组小鼠腹水增长缓慢，小鼠状态良好。低渗热灌注组和低渗热化疗组动物死亡早(最早死亡在第3天)，死亡率较高(分别达43.8%、37.5%)，且大体状态较差，体重增长缓慢，但平均生存期明显延长。

2.3体重变化

对照组随着腹水量产生的增加，体重增加明显；低渗组和低渗热灌注组体重略有增加且趋势相同；低渗热化疗组给予灌注后，体重呈下降趋势明显。

图1 各组小鼠体重变化情况

2.4腹水形成期、腹围及腹水量

建模后对照组平均腹水形成期7.5±0.5 d，平均最大腹围13.9±2.3 cm，腹水产生量大，死亡后解剖均为血性腹水，平均腹水量达26.8±4.7 ml，平均腹水细胞计数6.3×107/ml。与对照组相比，低渗组和低渗热化疗组平均腹水形成期明显延迟，各试验组平均腹围亦明显小于对照组(P<0.05)，观察到死亡后，解剖大多未见明显腹水。

表1 各组小鼠平均腹水形成期及平均最大腹围

*vs对照组，P<0.05；#vs低渗热化疗组，P<0.05。

2.5荷瘤生存期及生命延长率

对照组在荷瘤33天内全部死亡，平均荷瘤生存期23.1±6.5 d；与对照组比较，低渗组和低渗热化疗组均明显延长了荷瘤生存期，最长存活为87 d。其生命延长期分别达到97.4%和99.6%。

表1 各组小鼠平均荷瘤生存期及生命延长率

*vs对照组，P<0.05。

2.6解剖观察

对照组解剖呈现腹部膨隆、腹壁绷紧发亮，大量血性腹水，肝脏均有转移灶，个别出现脾脏和腹腔种植性转移；低渗组未见腹水或腹水量很少，解剖发现下腹壁有大小不一的局部结节；低渗热灌注组未见明显腹水，有肝脾出现转移灶，肝硬化，肠道肿胀黏连，腹腔种植性转移；低渗热化疗组死亡后亦未见腹水，肝脏受损严重，质硬钝圆，且出现转移灶的形成，脾大、肠道肿大明显，并有节段质坚硬，有的亦出现腹壁肿块。

3 讨论

癌性腹水是肝癌晚期患者常见的并发症，对患者生存质量会产生严重影响，亦可导致病情迅速恶化[5]。积极控制腹水能够延长患者生命，减轻痛苦，还可为进一步的治疗创造条件。肿瘤热疗是利用肿瘤细胞和正常细胞对温度有着不同的耐受能力，从而杀灭肿瘤细胞[6,7]。从目前临床有效的尝试来看，低渗、热疗以及联合化疗之间可能存在较好的增敏作用[8-10]。

对肝癌腹腔种植转移预防的研究，国内外文献报道较少。孙延富等[11]认为腹腔内游离癌细胞的数量能够在一定程度上预测对术后的种植转移发生率，通过有效减少游离的癌细胞可达到预防作用。张海斌等[12]报道，应用蒸馏水对腹腔进行充分冲洗后，对肝癌术后腹腔种植有一定的预防和治疗作用。缪骥等[13]报道，应用温热的蒸馏水在肝癌手术中进行持续灌洗10 min以上，可以杀灭游离的肝癌细胞，从而能够预防腹腔种植转移的发生。尽管早在20世纪60年代就开始了应用低渗蒸馏水杀灭肿瘤细胞的研究，但经不同临床应用发现，其效果并不确定。

本研究利用小鼠肝癌腹水瘤模型，行腹腔内保留式低渗、温热化疗，探讨某低渗液温热灌注以及联合化疗对腹水型肝癌的抑制作用，探讨其预防复发、转移的价值。实验结果显示，在荷瘤模型建立初期，腹腔灌注给予不同温度的低渗液，能够有效延长肝癌腹水形成期；通过体重、腹围、腹水量的观察，各试验组显著抑制了腹水的形成；低渗组和低渗热化疗组有效延长了荷瘤生存期和生命延长率，差异有统计学意义；但从解剖和大体观察来看，低渗热灌注组及低渗热化疗组对小鼠腹腔内脏器造成较大损伤，建模后两周内死亡率较高。这与临床应用并不一致。一般认为，肿瘤热疗的最佳温度为42.5℃-44℃， 低于 41℃无明显疗效，高于44℃ 可能对正常细胞造成损伤[1]。但我们通过实验发现，采用37℃温热灌注在控制腹水、延长生存期以及实验动物存活状态等方面，均优于较高的温度灌注以及联合化疗的作用，特别是较高温度灌注后，实验动物在短期内死亡率较高，联合化疗虽然有效延长了生存期，但化疗药物的副作用明显影响了实验动物的存活状态，解剖观察发现腹腔脏器损伤较严重。

本研究结果以期为某低渗液应用于预防肝癌腹腔种植转移提供实验依据，其作用机理及对机体产生的影响有待进一步深入研究。

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