加味四君子汤对结肠癌模型大鼠AQP-1、VEGF、COX-2表达的影响

李瑞芝 马浩清 金晓董 陈大贵

（1.海宁市中医院，浙江海宁314400； 2.海宁卫生学校药学教研室，浙江海宁314400；3.第二军医大学药学院，上海200433）

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在我国是第4位最常见的癌症和致死因素[1]。加味四君子汤是在四君子汤（党参、白术、茯苓、甘草）的基础上加入了薏苡仁、藤梨根、白花蛇舌草、石见穿、大血藤等药物，能益气健脾、扶正祛邪，近年来在肿瘤防治方面应用广泛，尤其是在肿瘤晚期正气亏虚之时，是扶正祛邪的常用良方。研究表明，四君子汤能有效诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，薏苡仁、白花蛇舌草、藤梨根等药物也具有一定的抗肿瘤效果[2-5]。本院临床上将该方应用于结肠癌治疗，疗效确切，但尚缺乏对该方抗结肠癌作用机制的系统研究。本实验以二甲肼（1-2dimethylhydrazine，DMH）皮下注射加2%葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液饮用诱导大鼠产生结肠癌，研究加味四君子汤对结肠癌模型大鼠环氧化酶-2（COX-2）、血管内皮生长因子（VEGF）和水通道蛋白（AQP-1）的影响，探讨中药治疗机制。

1 实验材料

1.1 动物 SD大鼠，60只，雌雄各半，160～180g，6周龄，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 药物、试剂与仪器 加味四君子汤（海宁市中医院制备），按配方称取药材党参20g、薏苡仁30g、白术15g、藤梨根30g、茯苓15g、石见穿30g、白花蛇舌草30g、大血藤30g、蜜甘草10g，加入10倍量的蒸馏水煎煮60min，过滤，取滤液，减压蒸馏浓缩制得水提物，保存备用。盐酸小檗碱片，上海信谊药业有限公司，批号22140712。DMH，上海星黍生物科技有限公司；DSS，上海生工生物；AQP-1、COX-2和VEGF酶标免疫试剂盒，上海星黍生物科技有限公司。JA2203A电子天平，上海精天电子仪器有限公司；光学显微镜及显微摄像系统，OLYMPUS公司；多功能酶标仪，美国Molecular Devices，型号SpectraMax M5。

2 实验方法

2.1 动物分组 大鼠适应性喂养1周，依据体重随机分为正常组、模型组、阳性药物组和加味四君子汤低、中、高剂量组，每组10只。

2.2 造模与给药 参照文献[6]，利用DMH加DSS诱导，预实验造模成功。造模开始第1周除正常组外所有大鼠给予DMH 40mg/kg颈部皮下注射，隔日1次，共3次；第2周给予除正常组外所有大鼠自由饮用2%DSS水溶液；第3、4周所有大鼠自由饮用自来水和摄食普通饲料。从第4周末开始，加味四君子汤低、中、高剂量组分别予中药10、20、40g/kg，1mL/100g大鼠体重灌胃；阳性药物组予盐酸小檗碱90mg/kg，1mL/100g大鼠体重灌胃。各给药组分别给药4周。

2.3 观察指标 每日上、下午分别观察1次各组大鼠的一般情况，如毛色、食量、大便性状、精神活动情况等，每周称量1次体重并记录。于实验第8周，各组大鼠用10%水合氯醛生理盐水溶液（0.3mL/100g大鼠体重）腹腔麻醉，取血清和直肠组织，ELISA试剂盒检测外周血中AQP-1、COX-2和VEGF含量，免疫组化检测结肠癌组织中COX-2和VEGF的表达，各组织切片采用HE染色法进行染色。

2.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 17.0统计软件处理，结果以（±s）表示，用ANVOA方差分析进行差异显著性检验。

3 实验结果

3.1 大鼠一般情况 造模第3周，部分造模大鼠出现腹股沟溃疡，活动明显减少，摄食和饮水量下降，皮毛不洁黯淡。给药第2周后，各给药组大鼠腹股沟溃疡开始逐渐痊愈，摄食和饮水有所好转，精神状态依然不佳。给药第4周，部分大鼠出现肛周溃疡伴有稀便和便血。加味四君子汤低、中、高剂量组和阳性药物组大鼠上述症状轻于模型组。

3.2 各组大鼠实验期间体重变化情况 造模3周开始，模型组大鼠体重明显低于正常组（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，各给药组能够不同程度地改善结肠癌引起的大鼠体重增长过慢（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

3.3 各组大鼠干预后血清COX-2、VEGF、AQP-1含量比较 结果见表2。模型组大鼠血清COX-2、VEGF、AQP-1含量均显著高于正常组（P＜0.01），各给药组COX-2含量明显低于模型组（P＜0.05），阳性药物组VEGF含量较模型组显著降低（P＜0.01），加味四君子汤中、高剂量组VEGF和AQP-1含量明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。加味四君子汤中、高剂量组COX-2和AQP-1含量与阳性药物组比较无统计学差异（P＞0.05），VEGF含量明显高于阳性药物组（P＜0.05）。加味四君子汤各剂量组之间各指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。上述结果初步表明加味四君子汤的治疗作用可能与降低血清COX-2、VEGF和AQP-1含量有关。

表1 各组大鼠实验各时期体重比较（±s） g

表1 各组大鼠实验各时期体重比较（±s） g

注： 与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性药物组比较，△P＜0.05。

体重造模前　　造模1周　　造模2周　　造模3周　　造模4周正常组　10　167.40±7.65　248.70±18.81　289.90±28.86　354.50±31.03　384.00±29.47模型组　10　168.30±9.62　217.50±18.52　265.30±31.81　317.30±36.22#338.30±33.85##阳性药物组　10　167.50±9.88　218.30±14.32　266.40±12.03　315.50±17.84　339.10±22.17加味四君子汤低剂量　10　166.10±7.85　218.20±11.59　263.20±18.00　308.70±15.61 333.70±18.68加味四君子汤中剂量　10　167.80±4.89　217.90±14.60　263.10±16.66　311.10±18.21　334.00±16.52加味四君子汤高剂量　10　165.90±7.98　219.60±12.21　268.50±17.90　312.20±23.03　334.30±22.34组别　　动物数（只）组别　　动物数（只）体重给药1周　　给药2周　　给药3周　　给药4周正常组　10　412.20±31.35　433.80±31.70　452.20±31.73　467.00±34.01模型组　10　347.60±46.57##　356.70±46.33##　367.60±52.49##　372.60±18.75##阳性药物组　10　374.40±26.81　401.20±28.41*　411.70±26.81*　432.20±35.06**加味四君子汤低剂量　10　363.10±23.03　381.60±29.88△　399.50±34.90　412.20±31.23**△加味四君子汤中剂量　10　365.20±20.44　380.60±20.66△　400.80±22.42　417.90±24.61**△加味四君子汤高剂量　10　369.90±34.47　394.30±32.70*　414.90±34.86*　432.10±37.51**

表2 各组大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比较（±s）

表2 各组大鼠血清COX-2、VEGF和AQP-1含量比较（±s）

注： 与正常组比较，##P＜0.01 ；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01 ；与阳性药物组比较，△P＜0.05。

组别　　动物数（只）　　剂量　COX-2（ng/L）　VEGF（µg/L）　AQP-1（pg/mL）正常组　10　62.50±3.60　127.52±19.11　2.58±0.17模型组　10　82.51±5.76##　165.25±11.79##　3.94±0.15##阳性药物组　10　90mg/kg　70.39±9.76*　125.85±22.12**　2.97±0.32加味四君子汤低剂量　10　10g/kg　76.47±6.15*　146.48±20.22　3.23±0.34加味四君子汤中剂量　10　20g/kg　70.87±7.53*　141.22±21.17*△　3.01±0.37*加味四君子汤高剂量　10　40g/kg　68.13±13.20*　138.16±15.41**△　2.99±0.34**

3.4 各组大鼠结肠癌组织中COX-2和VEGF表达比较 模型组大鼠肿瘤组织中COX-2、VEGF均呈强阳性表达，而各给药组阳性表达均有不同程度降低，见图1、图2。

4 讨论

结肠癌全身症状主要为腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热，局部症状有肛门内胀热灼痛、便意频繁、粪便混有黏液及血丝、里急后重、排尿不畅、尿频，由于其发病周期长，给患者、家庭及社会造成很大负担[7]。

DMH诱导的大鼠结肠癌变是一个长期、多因素共同参与的过程，其引起的细胞动力学及组织病理学变化和肿瘤形成的分子机制等均与人类的结肠癌形成过程相似，是研究结肠癌形成的良好模型[8]。因此，我们采用改良的DMH+DSS方法诱导大鼠形成结肠癌模型。AQP-1属于小分子疏水性内在膜蛋白家族，其主要

表达于胆管、胆囊、肾脏、胎盘、大脑和脉络丛等组织器官中[9]。Moon C等[10]研究发现，在结肠和直肠肿瘤形成的早期阶段AQP-1即可被诱导表达。AQP-1与肿瘤

的血管发生与转移有密切关系，具体表现为对内皮细胞迁移具有促进作用，促进肿瘤血管生成，同时增强肿瘤的侵袭和转移能力。与野生型小鼠相比，AQP-1基因敲除小鼠体内植入肿瘤的生长速度明显减慢，因此可利用药物抑制AQP-1介导的快速水转运，使内皮细胞因在迁移过程中缺乏局部跨膜离子流而不能形成细胞膜突出，减慢细胞迁移速率[11]。上皮细胞和免疫细胞分泌的各种炎性因子在肠肿瘤形成的过程中起到了关键作用，而COX-2在炎症发生过程中起到重要作用。它作为一种诱导型酶，在正常组织不表达，可由促炎性因子、生长因子、癌基因等诱导表达。Oshima等[12]发现与野生小鼠相比，COX-2基因敲除的APCdelta716小鼠腺癌的数量和大小明显改善，因此抑制COX-2可有效预防结肠癌。另有研究表明，VEGF主要参与了新生血管和淋巴管的形成，其中新生血管有助于肿瘤生成，进而导致肿瘤转移。VEGF在结直肠癌中高表达与肿瘤的侵润和转移有正相关性，是结肠癌诊断以及预后估计的重要指标[13]。

图1 各组大鼠结肠癌组织中COX-2表达比较（×200）

图2 各组大鼠大鼠结肠癌组织中VEGF表达比较（×200）

本研究结果表明，加味四君子汤可降低结肠癌模型大鼠COX-2、VEGF和AQP-1含量，这可能是其治疗结肠癌的作用机制。日本学者Soumaoro LT[14]在结直肠癌研究中发现COX-2、VEGF呈正相关性，两者与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期密切相关。本研究为加味四君子汤对结肠癌的治疗提供了一定的实验依据，关于加味四君子汤对结肠癌治疗作用的其他相关机制，还有待进一步研究。

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